프리온 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 유제동물 및 그의 용도 {TRANSGENIC UNGULATES HAVING REDUCED PRION PROTEIN ACTIVITY AND USES THEREOF}
일반적으로, 본 발명은 하나 이상의 유전적으로 조작된 돌연변이에 의해 프리온 단백질 (PrP) 활성이 감소된 클로닝된 트랜스제닉(transgenic) 유제동물(예, 소과 동물)을 특징으로 한다. 프리온(prion) 단백질 활성이 감소된 이러한 트랜스제닉 소과 동물은 프리온-관련 질병, 예를 들어 소과 동물 해면 상뇌증(BSE, 광우병이라고도 알려짐)에 내성이 있기 때문에 농업 제품 및 제약 제품, 예를 들어 인간 치료 항체에 대한 안전하고 바람직한 공급원이다.
BSE가 1986년 영국에서 최초로 발견된 이후, 이 감염성 질병은 세계의 다른 지역, 예를 들어 일본으로 확산되었다. 이 질병의 위협은 농업 및 제약 분야에 큰 영향을 끼치며, 이들 산업에서 소과류 동물의 이용을 제한한다. 10년 이상의 연구를 토대로, 프리온 단백질이 상기 감염성 질병의 실질적인 원인인 것으로 확인되었다. 프리온 단백질 활성이 감소된 동물들은 프리온 단백질-관련 감염에 대해 내성을 갖는 것으로 예상되기 때문에 바람직하다.
지금까지는 상동 재조합에 능숙한 쥐과 동물 배아 줄기(ES) 세포에서 통상의 유전자 표적화 전략을 이용하여 프리온 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 마우스를 생성시켜 왔다. 그러나, 소과류 동물과 같은 유제동물 유래의 ES 세포는 단리 및 배양이 어려우며, 유전적으로 변형시키기도 어렵다.
프리온 녹아웃(knockout) 양을 생성시키는데 있어서, 프리온 단백질 유전자가 태아 섬유아세포에서 매우 활발하게 발현되기 때문에, 태아 섬유아세포를 프로모터 무함유 녹아웃(KO) 벡터로 형질감염시킨다 [Denning et al., Nature Biotech., 19:559-562, 2001]. 이러한 유형의 녹아웃 벡터를 이용함으로써 적절한 약물, 예를 들어 G418 또는 퓨로마이신을 사용하여 상동성으로 표적화된 클론을 선별할 수 있는데, 그 이유는 녹아웃 벡터내의 프로모터 무함유 약물-내성 유전자(예, 네오마이신 또는 퓨로마이신-내성 유전자)가 활발하게 발현되는 유전자 로커스(locus)에 통합되는 경우에만 발현될 수 있기 때문이다. 그러나, 이러한 반접합성(hemizygous)으로 표적화된 양과 동물 섬유아세포의 핵 전달에 의해 살아있는 양이 단지 한 마리만 생산되었으며, 이후 이 양은 출생 후 약 12일에 사망하였다. 무제한의 수명을 갖는 쥐과 동물 ES 세포와는 달리, 체세포 섬유아세포는 제한된 수명을 가지는데, 이로 인해 목적하는 녹아웃 세포를 선별하기 위한 엄격한 약물 선별하에 세포를 배양하는데 긴 시간이 필요하기 때문에 체세포 유전자의 표적화가 어려워진다. 또한, 일반적으로, 체세포 섬유아세포에서 상동 재조합의 빈도는 쥐과 동물 ES 세포에서의 빈도보다 약 10배 내지 100배 더 낮다. 종래의 핵 전달 방법의 낮은 성공율 이외에도 체세포 섬유아세포에 관련된 상기 제한들로 인해 목적하는 부위-특이적 돌연변이를 갖는 생존가능한 가축을 생산하기란 어려운 일이었다.
소과류 동물에서 유전자 표적화에 의해 프리온 단백질의 활성을 감소시키려는 시도가 있어왔다. 본 발명에 이르기까지 프리온 로커스에서 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 소과 동물을 성공적으로 생성시킨 사례는 보고된 바 없는데, 아마도 적절한 녹아웃 벡터 및(또는) 핵 전달 방법이 없었기 때문일 것이다. 따라서, 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)내 프리온 로커스를 고효율로 돌연변이시키는 개선된 녹아웃 벡터가 필요한 실정이다. 추가로, 유전적으로 변형된 이러한 공여자 세포로부터 트랜스제닉 유제동물 (예, 소과 동물)을 생성시키기 위한 개선된 방법이 바람직하다.
발명의 개요
본 발명은 유제동물(예, 소과 동물)내 공여자 세포, 예를 들어 태아 체세포 섬유아세포의 프리온 로커스에서 반접합성 및 동종접합성(hom*ozygous) 표적화된 통합 (이른바, 상동 재조합)을 매우 높은 효율로 달성할 수 있는 녹아웃 벡터의 설계를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 유전적으로 변형된 공여자 세포를 사용하여 본원에 기재된 임의의 핵 전달 방법으로 프리온 로커스에서 반접합성 또는 동종접합성 돌연변이를 갖는 살아있는 송아지를 생산하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 소과류 동물은 제약 및 농업 제품, 예를 들어 인간에 사용하기 위한 인간 치료 항체를 생산하는데 유용하다.
본 발명의 방법은 여러 기술, 예를 들어 (i) 본원에 기술된 프리온 유전자 녹아웃 세포 기술, (ii) 포유동물 클로닝 방법, 예를 들어 PCT 공개 제W0 02/051997호에 개시된 핵 전달 또는 염색질 전달 기술, 및 (iii) 인간 인공 염색체 (HAC), 예를 들어 델타 HAC를 유제동물에 도입하는 기술 [PCT 공개 제W0 02/70648호; Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 20:889-894, 2002]을 이용하여 달성한다. 프리온 녹아웃 유제동물 세포는 포유동물 클로닝 방법에서 공여자 유전 물질의 공급원으로 사용되어 프리온 녹아웃 (헤미 또는 호모) 자손을 생성시킨다.
프리온 녹아웃 유제동물은 인간 항체를 생산하는 것과 같은 다른 유용한 특징을 가질 수도 있다. 이러한 유제동물은 상기 기술들을 조합하여 사용함으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 프리온 녹아웃 및 인간 항체-생산 소과 동물은 PCT 공개 제W0 02/70648호에 기술된 바와 같이 프리온 녹아웃 유제동물과 인간 항체-생산 유제동물을 이종교배하여 생성시킬 수 있다. 태아 섬유아세포의 연속 조작을 이용하여 유제동물을 교배하거나 교배하지 않고 상기 유제동물을 생성시킬 수도 있다. 소과 동물 태아 섬유아세포의 연속 조작은 다음과 같은 단계들을 반복하는 것을 포함한다: (i) 유제동물 (예, 소과 동물) 섬유아세포의 유전적 조작, (ii) 이 세포를 사용한 포유동물 클로닝, (iii) 태아 생성, 및 (iv) 유전적으로 변형된 태아 섬유아세포의 단리. 예를 들어, 프리온 녹아웃 섬유아세포가 HAC를 보유하고 내인성 Ig 유전자를 불활성화하도록 연속 조작할 수 있다.
생성된 모노클로날 또는 폴리클로날 이종(xenogenous) 항체는 다양한 용도를 가지며, 예를 들어 상기 항체를 박테리아 또는 바이러스와 같은 병원성 미생물의 감염에 대한 예방 또는 치료 조성물 중의 성분으로 사용할 수 있다.
트랜스제닉 유제동물 및 유제동물 세포
한 측면에서, 본 발명은 내인성 프리온 핵산의 하나 또는 두 대립유전자에서의 비-자연 발생 돌연변이 (예, 개시 ATC 코돈 이후의 돌연변이, 예를 들어 이 코돈의 뉴클레오티드 10개, 20개, 50개 또는 100개 이내에 있는 돌연변이)를 갖는 유제동물 (예, 소과 동물) 또는 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)를 제공한다. 바람직하게는, 상기 돌연변이는 기능성 프리온 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 실질적으로 제거한다. 바람직한 실시양태에서, 기능성 또는 전체 프리온 단백질의 발현은 적어도 10％, 20％, 40％, 60％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％ 감소된다. 돌연변이는 반접합성 또는 동종접합성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 프리온 핵산에 삽입된 양성 선별 마커 (예, 항생제 내성 유전자)를 포함한다. 바람직하게는, 양성 선별 마커가 이종 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프리온 핵산의 두 대립유전자에 삽입된 항생제 내성 유전자를 갖는 유제동물 또는 유제동물 세포의 경우, 각 대립유전자는 동일 또는 상이한 항생제 내성 유전자를 함유할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 음성 선별 마커 (예, DT-A 또는 Tk)가 이종 프로모터에 작동가능하게 연결되며, 내인성 프리온 대립유전자를 돌연변이시키는데 사용된 벡터내에 존재한다. 돌연변이는 프리온 핵산내 하나 이상의 뉴클레오티드 (예, 인접 뉴클레오티드)의 결실을 포함할 수도 있고, 포함하지 않을 수도 있다.
상기 측면의 바람직한 실시양태에서, 유제동물 (예, 소과 동물) 또는 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)는 하나 이상의 트랜스진(transgene)을 가지며, 상기 트랜스진(들)에 의해 코딩된 mRNA 또는 단백질 (예, 항체)을 발현시킨다. 바람직한 유제동물은 인간 염색체의 자연적으로 배열된 절편 (예, 인간 염색체 단편) 또는 인공적으로 조작된 인간 염색체 단편을 포함하는 인공 염색체 (즉, 단편은 인간 게놈에 대하여 재배열될 수 있음)를 함유한다. 일부 실시양태에서, 이종 핵산은 염색체 단편내에 함유된다. 핵산은 유제동물의 염색체에 통합되거나 또는 유제동물 세포에서 숙주 염색체와 독립적으로 유지될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 핵산은 염색체 단편, 예를 들어 △HAC 또는 △△HAC에 함유된다. 다른 실시양태에서, 이종 항체는 다른 속 유래의 항체, 예를 들어 인간 항체이다.
바람직한 유제동물 및 유제동물 세포는 하나 이상의 B-세포내에 이종 항체 유전자 로커스를 갖는 하나 이상의 핵산 (예, 재배열을 수행하며 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현시키는 이종 이뮤노글로불린(Ig) 유전자의 전체 또는 일부를 코딩하는 핵산)을 갖는다. 바람직하게는, 핵산은 재배열되지 않은 항체 경쇄 핵산 절편을 가지며, 여기서 V 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체가 J 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체로부터 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 다른 바람직한 핵산은 재배열되지 않은 항체 중쇄 핵산 절편을 가지며, 여기서 (i) V 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체가 D 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체로부터 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되고(되거나) (ii) D 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체가 J 유전자 절편을 코딩하는 핵산 절편의 전체로부터 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 다른 바람직한 유제동물은 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현시키는 재배열된 이종 이뮤노글로불린(Ig) 유전자의 전체 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖는다.
다른 바람직한 실시양태에서, 이종 항체의 경쇄 및(또는) 중쇄는 인간 핵산에 의해 코딩된다. 바람직한 실시양태에서, 중쇄는 임의의 종류의 중쇄, 예를 들어 μ, γ, δ, ε 또는 α이고, 경쇄는 람다 또는 카파 경쇄이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이종 이뮤노글로불린 쇄 또는 항체를 코딩하는 핵산은 재배열되지 않은 형태로 존재한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이종 항체의 하나 이상의 종류가 유제동물에 의해 생성된다. 다양한 실시양태에서, 하나 초과의 상이한 이종 Ig 또는 항체가 유제동물에 의해 생산된다. 이종 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다.
상기 측면의 다양한 실시양태에서, 유제동물 (예, 소과 동물) 또는 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)는 내인성 항체의 발현을 감소시키는 돌연변이를 가질 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 기능성 IgM 중쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능성 IgM 중쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 기능성 Ig 경쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능성 Ig 경쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 기능성 IgM 중쇄 및 기능성 Ig 경쇄의 발현을 감소시키거나 또는 기능성 IgM 중쇄 및 기능성 Ig 경쇄의 발현을 실질적으로 제거한다. 바람직하게는, 유제동물은 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 및(또는) J 쇄를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자에서의 돌연변이를 갖기도 한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 유제동물은 외인성 J 쇄, 예를 들어 인간 J 쇄를 코딩하는 핵산을 갖는다. 바람직하게는, 돌연변이는 내인성 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 효소, 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프, 및(또는) J 쇄의 발현을 감소시키거나 또는 제거한다. 바람직하게는, 유제동물은 인간 J 쇄를 함유하는 인간 IgA 또는 IgM 분자를 생산한다. 바람직한 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)는 체세포, 예를 들어 태아 섬유아세포 또는 B-세포를 포함한다.
또한, 본 발명은 이종 (예, 인간) 항체를 생산하는 하이브리도마를 특징으로 한다. 이러한 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 B-세포와 골수종 세포의 융합으로부터 형성된 하이브리도마를 제공한다. 바람직하게는, 항체는 대상 항원과 반응성이다.
트랜스제닉 유제동물 세포의 생성 방법
또한, 본 발명은 프리온 핵산의 하나 또는 두 대립유전자에서의 돌연변이를 갖는 유제동물 세포 (예, 소과 동물 세포)의 생성 방법을 특징으로 한다. 이러한 세포는 트랜스제닉 유제동물 (예, 소과 동물 프리온 녹아웃 유제동물)의 생성을 위한 공여자 세포로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 기능성 프리온 단백질의 양을 감소시키고(시키거나) 프리온 관련 감염 또는 질병, 예를 들어 BSE의 발생을 감소시킨다.
따라서, 이러한 한 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 유제동물 (예, 소과 동물)의 생성 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 유제동물 세포에서 제1 프리온 유전자 표적화 벡터와 내인성 프리온 핵산의 제1 대립유전자 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에 상기 세포에 상기 제1 벡터를 도입함으로써 상기 세포에 반접합성 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 제1 벡터는 세포의 내인성 프리온 핵산의 제1 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 상동성 영역, 양성 선별 마커, 및 프리온 핵산의 제2 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 상동성 영역을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 하나의 상동성 영역은 다른 상동성 영역보다 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 8 킬로베이스 더 길다. 바람직하게는, 상기 방법은 또한 상기 세포에서 상기 제1 벡터와 내인성 프리온 핵산의 제2 대립유전자 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에 상기 세포에 상기 제1 벡터를 재도입함으로써 상기 세포에 동종접합성 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 이 방법은 또한 상기 세포에서 상기 제1 벡터와 상이한 항생제 내성 유전자를 갖는 제2 프리온 유전자 표적화 벡터와 내인성 프리온 핵산의 제2 대립유전자 사이의 상동 재조합을 허용하는 조건하에 상기 세포에 상기 제2 벡터를 도입함으로써 상기 세포에 동종접합성 돌연변이를 도입하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 1 mM의 스페르미딘의 존재하에 세포에 제1 및(또는) 제2 벡터를 도입한다. 바람직한 세포로는 소과 동물 태아 섬유아세포가 포함된다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 내인성 프리온 핵산을 돌연변이시키는데 사용된 핵산 (예, 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 프리온 핵산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 녹아웃 카세트)은 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터에 함유되지 않는다. 예를 들어, 세포의 바이러스 감염을 포함하지 않는 형질감염 또는 리포형질감염과 같은 표준 방법을 이용하여, 유제동물 세포에 삽입되는 플라스미드 또는 인공 염색체에 핵산을 함유시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 내인성 프리온 핵산을 돌연변이시키는데 사용된 핵산 (예, 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 프리온 핵산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 녹아웃 카세트)은 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스 벡터 또는 아데노-관련 바이러스 벡터에 함유된다. 이러한 실시양태에 따라, 바이러스 벡터 함유 바이러스를 사용하여 유제동물 세포를 감염시킴으로써 바이러스 벡터의 일부 또는 전체를 유제동물 세포에 삽입한다.
트랜스제닉 유제동물의 생성 방법
또한, 본 발명은 내인성 프리온 핵산내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 유제동물 생성 방법을 제공한다. 이러한 한 방법은 본 발명의 상기 측면들 중 어떤 측면의 세포, 이 세포 유래의 염색질 덩어리 또는 상기 세포 유래의 핵을 난모세포에 삽입하는 것을 포함한다. 세포는 내인성 프리온 핵산내에 제1 돌연변이를 갖는다. 난모세포 또는 이 난모세포로부터 형성된 배아가 태아로 발육하도록 허용하는 조건하에 상기 난모세포 또는 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달한다. 바람직하게는, 태아가 생존가능한 자손으로 발육한다.
바람직한 실시양태에서, 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 내인성 프리온 핵산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 카세트를 포함하는 핵산을 삽입함으로써 상기 카세트를 프리온 핵산의 하나의 내인성 대립유전자에 통합시켜 세포에 제1 돌연변이를 도입한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 내인성 프리온 핵산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 핵산에 작동가능하게 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 카세트를 포함하는 핵산을 상기 세포에 삽입함으로써 상기 제1 카세트를 제1 트랜스제닉 세포를 생성하는 프리온 핵산의 제1 내인성 대립유전자에 통합시켜 세포에 돌연변이를 도입한다. 제2 선별가능한 마커를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되고 프리온 핵산과 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 핵산에 작동가능하게 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 카세트를 포함하는 핵산을 상기 제1 트랜스제닉 세포에 삽입한다. 제2 선별가능한 마커는 제1 선별가능한 마커와 차이가 있으며, 제2 카세트는 제2 트랜스제닉 세포를 생성하는 프리온 핵산의 제2 내인성 대립유전자에 통합된다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포를 배아, 태아, 또는 상기 태아로부터 생산된 자손으로부터 단리하고, 다른 돌연변이를 상기 세포의 프리온 핵산 또는 또 다른 핵산 (예, 항체 중쇄 또는 경쇄 핵산)에 도입한다. 이어서, 생성된 세포, 이 세포 유래의 염색질 덩어리 또는 상기 세포 유래의 핵을 사용하여 핵 전달의 제2 라운드를 수행함으로써 두가지 이상의 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 유제동물을 생성한다. 돌연변이는 유전자의 동일 또는 상이한 대립유전자에 존재하거나 또는 다른 유전자에 존재한다. 핵 전달의 제1 라운드 또는 임의의 제2 라운드에서 사용된 세포는 이종 항체를 코딩한다. 특정의 실시양태에서, 세포는 B-세포에서 재배열을 수행하며 하나 이상의 이종 Ig 분자를 발현시킬 수 있는 이종 Ig 유전자의 전체 또는 일부를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 돌연변이되는 세포는 섬유아세포 (예, 태아 섬유아세포)이다. 바람직하게는, 돌연변이되는 내인성 유전자는 섬유아세포에서 활성이 없는 내인성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 돌연변이되는 내인성 유전자에 작동가능하게 연결된 내인성 프로모터는 GAPDH와 같은 내인성 하우스키핑 유전자에 작동가능하게 연결된 내인성 프로모터 활성의 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％ 또는 10％ 미만이다. 프로모터 활성은 유전자에 의해 코딩된 mRNA 또는 단백질의 수준을 측정하는 분석법과 같은 임의의 표준 분석법을 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13. 3, John Wiley & Sons, 1995] 참조). 트랜스제닉 유제동물을 생성하는 상기 방법은 공여자 세포 (즉, 핵 전달에 사용된 유전 물질의 공급원인 세포)에서 발현되지 않는 유전자를 돌연변이시킬 수 있다는 이점을 갖는다.
바람직하게는, 트랜스제닉 유제동물의 생성에 사용된 세포는 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 및(또는) J 쇄를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 두 대립유전자에서의 돌연변이를 갖는다. 다른 바람직한 실시양태에서, 세포는 외인성 J 쇄, 예를 들어 인간 J 쇄를 코딩하는 핵산 또는 이종 항체를 코딩하는 핵산을 갖는다. 바람직하게는, 이종 핵산은 이종 Ig 유전자의 전체 또는 일부를 코딩하며, 상기 유전자는 B-세포에서 재배열을 수행하며 하나 초과의 이종 Ig 분자를 발현시킬 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 항체는 폴리클로날 항체이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 이뮤노글로불린 쇄 또는 항체는 혈청 및(또는) 젖에서 발현된다.
상기에서 본 발명자들은 프리온 핵산내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 포유동물을 클로닝하는데 사용될 수 있는, 포유동물 (예, 유제동물, 예를 들어 소과 동물)의 클로닝을 위한 다양한 개선된 방법을 개시하였다 (예, 미국 특허 공개 제2002-0046722 A1호 및 PCT 공개 제W0 02/051997호 참조). 이들 몇몇 방법에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍(reprogramming) 배지 (예, 세포 추출물)와 인큐베이션하여 세포 유래의 인자를 부가 또는 제거한 다음, 투과가능해진 세포의 원형질막을 재밀봉하여 목적 인자들을 원형질막으로 둘러싸고, 세포의 막 일체성을 복구한다. 또한, 상기 몇몇 방법들은 공여자 핵 (예, 단리된 핵 또는 공여자 세포내의 핵)을 염색질 덩어리로 응축시킴으로써, 핵 이식 배아가 생존가능한 자손으로 발육하는데 바람직하지 않은 유전자의 전사를 촉진시킬 수 있는 전사 인자와 같은 핵 성분을 방출시킨다. 필요하다면, 상기 임의의 방법들을 1회 이상 반복하거나 또는 다른 리프로그래밍 방법을 연속적으로 수행하여 리프로그래밍 정도를 증가시킴으로써 클로닝된 태아의 생존능을 더 크게 할 수 있다.
트랜스제닉 유제동물 (예, 소과 동물)을 생성하는 한가지 방법은 본 발명의 상기 임의의 측면들의 투과가능해진 세포 (예, 내인성 프리온 핵산내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 세포)의 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체 유래의 인자(예, 핵 또는 세포질 성분, 예를 들어 전사 인자)가 제거되거나 또는 인자가 상기 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로 부가되도록 허용하는 조건하에 상기 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 (예, 세포 추출물)와 인큐베이션함으로써 리프로그래밍된 세포를 형성시키는 것을 포함한다. 리프로그래밍된 세포를 핵제거된(enucleated) 난모세포에 삽입하고, 생성된 난모세포 또는 이 난모세포로부터 형성된 배아가 태아로 발육하도록 허용하는 조건하에 상기 난모세포 또는 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달한다. 바람직한 실시양태에서, 염색질 덩어리의 형성을 허용하는 조건하에 투과가능해진 세포를 다음의 것들 중 하나 이상과 접촉시킨다: 항-NuMA 항체의 존재 또는 부재하의 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 간기 리프로그래밍 배지 (예, 간기 세포 추출물)와 인큐베이션한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포내의 핵은 막에 결합되어 있으며, 핵내의 염색체는 상기 간기 리프로그래밍 배지와의 인큐베이션 동안 응축하지 않는다. 어떤 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 중에서 인큐베이션하면 DNA 복제가 일어나지 않거나 또는 DNA 복제가 세포의 50, 40, 30, 20, 10 또는 5％ 미만으로만 일어난다. 다른 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 중에서 인큐베이션하면 DNA 복제가 세포의 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 100％로 일어난다. 다양한 실시양태에서, 무손상 세포를 프로테아제, 예를 들어 트립신, 디터전트, 예를 들어 디지토닌, 또는 박테리아 독소, 예를 들어 스트렙토리신 O와 인큐베이션함으로써 투과가능해진 세포를 형성한다. 바람직한 실시양태에서, 난모세포로 삽입되기 전에 리프로그래밍된 세포막이 재밀봉되도록 허용하는 조건하에 리프로그래밍된 세포를 인큐베이션하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 난모세포로 삽입되기 전에 리프로그래밍된 세포막이 재밀봉되도록 허용하는 조건하에 리프로그래밍된 세포를 인큐베이션한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 재구성된 난모세포 또는 생성된 배아는 라민 A, 라민 C 또는 NuMA 단백질을, 동일한 수의 세포를 가지며 동일한 종에서 유래하는 대조군 난모세포 또는 대조군 배아에 의해 발현되는 상응하는 수준보다 5배 미만의 수준으로 발현시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 유제동물 (예, 소과 동물)의 또 다른 생성 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) DNA 복제를 유발하지 않고 염색질 덩어리가 형성되도록 허용하는 조건하에 본 발명의 세포 유래의 공여자 핵 (예, 내인성 프리온 핵산내 하나 이상의 돌연변이를 갖는 핵)을 인큐베이션 하는 단계, (b) 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포에 삽입함으로써 핵 전달 난모세포를 형성시키는 단계, 및 (c) 핵 전달 난모세포 또는 이 핵 전달 난모세포로부터 형성된 배아가 태아로 발육하도록 허용하는 조건하에 상기 핵 전달 난모세포 또는 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 핵 또는 세포질 성분, 예를 들어 전사 인자, 리프레서 단백질 또는 염색질 리모델링 단백질이 핵 또는 생성된 염색질 덩어리로 부가되거나 또는 핵 또는 생성된 염색질 덩어리로부터 제거되도록 허용하는 조건하에 공여자 핵을 리프로그래밍 배지 (예, 세포 추출물)와 인큐베이션한다. 바람직하게는, 염색질 덩어리가 형성되도록 허용하는 조건하에 공여자 핵을 다음의 것들 중 하나 이상과 접촉시킨다: 항-NuMA 항체의 존재 또는 부재하의 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액. 다른 바람직한 실시양태에서, 재구성된 난모세포 또는 생성된 배아는 라민 A, 라민 C 또는 NuMA 단백질을, 동일한 수의 세포를 가지며 동일한 종에서 유래하는 대조군 난모세포 또는 대조군 배아에 의해 발현되는 상응하는 수준보다 5배 미만의 수준으로 발현시킨다. 바람직하게는, 핵은 4 세트 미만의 상동 염색체를 갖는다 (즉, 2쌍 미만의 완전한 염색분체를 가짐).
키메라 유제동물을 생성시키는 바람직한 방법
다른 바람직한 유제동물은 2 개 이상의 배아로부터의 세포를 사용하여 생성시킨 키메라 유제동물이다. 예를 들어, 핵 전달 배아 (예를 들어, 세포, 핵 또는 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포에 삽입시켜 형성된 배아)로부터의 세포는 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아로부터의 세포와 조합될 수 있다. 핵 전달 배아로부터의 세포 및 그의 자손의 대부분을 생성된 키메라 배아의 태아 조직에 혼입시키는 것이 바람직하다. 제2 배아로부터의 세포 및 그의 자손의 적어도 일부를 바람직하게는 태반 조직에 혼입시켜, 생성된 키메라 배아의 생존능을 증진시킨다. 바람직한 실시양태에서, 핵 전달 배아는 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 이종 항체를 코딩하는 핵산을 갖는다.
따라서, 이러한 한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 핵 또는 염색질 덩어리 (예를 들어, 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 세포, 핵 또는 염색질 덩어리)를 난모세포에 삽입함으로써 제1 배아를 형성시켜 트랜스제닉 유제동물을 생성시키는 방법을 제공한다. 제1 배아로부터의 1 개 이상의 세포를 제2 배아로부터의 1 개 이상의 세포와 접촉시킴으로써 제3 배아를 형성시킨다. 제2 배아는 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아이다. 제3 배아가 태아로 발육되도록 허용하는 조건하에 제3 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달한다.
다른 관련 측면에서, 본 발명은 트랜스제닉 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)을 생성시키는 다른 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 투과가능해진 세포 (예를 들어, 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 세포)를 투과가능해진 세포의 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로부터의 인자가 제거되거나 리프로그래밍 배지로부터 상기 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로 인자가 부가되도록 허용하는 조건하에 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물) 중에 인큐베이션함으로써 리프로그래밍된 세포를 형성시키는 단계를 포함한다. 리프로그래밍된 세포를 핵제거된 난모세포에 삽입함으로써 제1 배아를 형성시킨다. 제1 배아로부터의 1 개 이상의 세포를 시험관내 수정되거나, 자연 발생적이거나 또는 단성생식적으로 활성화된 제2 배아로부터의 1 개 이상의 세포와 접촉시킴으로써 제3 배아를 형성시킨다. 제3 배아가 태아로 발육되도록 허용하는 조건하에 제3 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달한다.
바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)와 함께 핵 또는 세포질 성분, 예를 들어 전사 인자를 핵 또는 생성된 염색질 덩어리로 부가되거나 핵 또는 생성된 염색질 덩어리로부터의 제거되도록 허용하는 조건하에 인큐베이션한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 염색질 덩어리의 형성을 허용하는 조건하에 다음 성분들 중 1 종 이상과 접촉시킨다: 항-NuMA 항체의 존재 또는 부재하의 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액. 다른 바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 간기(interphase) 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 간기 세포 추출물)와 함께 인큐베이션한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 투과가능해진 세포의 핵은 막에 결합된 채로 유지되며 핵의 염색체는 상기 간기 리프로그래밍 배지와의 인큐베이션 동안 응축하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 중에서 인큐베이션하는 것은 DNA 복제를 유발하지 않거나 또는 세포의 단지 50％, 40％, 30％, 20％, 10％ 또는 5％ 미만에서만 DNA 복제를 유발한다. 다른 실시양태에서, 투과가능해진 세포를 리프로그래밍 배지 중에서 인큐베이션하는 것은 세포의 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％에서 DNA 복제를 유발한다. 다양한 실시양태에서, 투과가능해진 세포는 무손상 세포를 프로테아제, 예를 들어 트립신, 디터전트, 예를 들어 디지토닌 또는 박테리아 독소, 예를 들어 스트렙토리신 O(Streptolysin O)과 인큐베이션하여 형성된다. 바람직한 실시양태에서, 리프로그래밍된 세포는 난모세포로의 삽입 이전에는 리프로그래밍된 세포막의 재밀봉을 허용하는 조건하에 인큐베이션하지 않는다. 다른 실시양태에서, 리프로그래밍된 세포는 난모세포로의 삽입 이전에 리프로그래밍된 세포막의 재밀봉을 허용하는 조건하에 인큐베이션한다.
다른 실시양태에서, 유제동물은 본 발명의 세포로부터의 공여자 핵 (예를 들어, 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 핵)을 염색질 덩어리의 형성을 허용하는 조건하에 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)와 접촉시키고, 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포에 삽입함으로써 제1 배아를 형성시켜 생성된다. 제1 배아로부터의 1 개 이상의 세포를 시험관내 수정되거나, 자연 발생적이거나 또는 단성생식적으로 활성화된 제2 배아로부터의 1 개 이상의 세포와 접촉시켜 제3 배아를 형성시킨다. 제3 배아가 태아로 발육되도록 허용하는 조건하에 제3 배아를 숙주 유제동물의 자궁으로 전달한다. 바람직한 실시양태에서, 4 세트 미만의 상동 염색체를 갖는 공여자 핵을, DNA 복제를 유발하지 않으면서 염색질 덩어리의 형성을 허용하는 조건하에 리프로그래밍 배지와 접촉시켜 염색질 덩어리를 형성시킨다. 공여자 핵을 염색질 덩어리의 형성을 허용하는 조건하에 다음 성분들 중 1 종 이상과 접촉시키는 것이 바람직하다: 항-NuMA 항체의 존재 또는 부재하의 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액.
두가지 배아로부터의 세포를 사용하여 생성시킨 유제동물을 포함하는 상기 임의의 측면의 바람직한 실시양태에서, 제1 배아 및 제2 배아 중 적어도 하나는 밀집(compaction) 배아이다. 다른 실시양태에서, 제1 배아 및 제2 배아는 상이한 세포 단계에 있다. 제2 배아를 생성시키는데 사용되는 제1 배아 및 공여자 세포는 동일 종 또는 상이한 속 또는 종으로부터 유래될 수 있다. 태아의 영양외배엽(trophectoderm) 또는 태반 조직의 세포의 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％가 제2 배아로부터 유도되거나 또는 태아의 내부 세포 덩어리 또는 태아 조직의 세포의 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％가 제1 배아로부터 유도되는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 제1 배아 또는 제3 배아는 라민 A, 라민 C 또는 NuMA 단백질을 동일 수의 세포를 가지며 동일 종으로부터 유래하는 대조군 배아에 의해 발현되는 상응하는 수준보다 5배 미만으로 더 많이 발현시킨다.
두가지 배아로부터의 세포를 사용하여 생성시킨 유제동물을 포함하는 상기 임의의 측면의 바람직한 실시양태에서, 제1 배아 또는 제2 배아의 투명대(zona pellucida)의 일부 또는 전체는 각 배아로부터의 세포들을 접촉시키기 전에 제거한다. 한 실시양태에서, 제1 배아 및 제2 배아로부터의 세포를 용액 중에서 또는 고상 지지체 상에서 서로 인접하게 위치시켜 접촉시킨다. 다른 실시양태에서, 표준 기술을 이용하여 제1 배아로부터의 세포를 제2 배아에 주입시킨다. 세포는 제2 배아의 임의의 영역, 예를 들어 투명대와 배아 자체 사이에 있는 배아의 주변부에 주입할 수 있다. 자연 발생 배아로는 표준 방법을 이용하여 임신한 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)로부터 수술적 또는 비수술적으로 적출한 배아 등이 있다. 시험관내 수정된 배아로는 표준 방법을 이용하여 생성시킨 세포질내 정자 주입 배아 등이 있다. 2 종 초과의 배아로부터의 세포 (예를 들어, 3 종, 4 종, 5 종, 6 종 또는 그보다 많은 배아로부터의 세포)를 조합하여 클로닝된 유제동물을 생성시키기 위한 키메라 배아를 형성시키는 것이 또한 고려된다.
유제동물을 생성시키기 위한 바람직한 실시양태
상기 임의의 측면의 바람직한 실시양태에서, 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성자 또는 리프레서와 같은 인자를 풍부하게 하거나 또는 고갈시켜 변형시킨다. 다른 바람직한 실시양태에서, 난모세포 또는 키메라 배아에서 NuMA 또는 AKAP95 단백질의 발현 수준은 세포질에서보다 핵에서 적어도 2배, 5배, 10배 또는 20배 더 높다. 다른 실시양태에서, 난모세포 또는 키메라 배아에서 AKAP95 단백질의 적어도 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％를 0.1％ 트리톤(Triton) X-100, 1 mg/ml DNAse I 및 100 mM 또는 300 mM NaCl의 용액으로 추출한다. 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포로의 삽입 이전에 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 추출물)로부터 정제하는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포에 삽입하는 것은 염색질 덩어리 및 난모세포를 염색질 덩어리의 난모세포로의 진입을 허용하는 조건하에 융합발생(fusigenic) 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 태아는 생존가능한 자손으로 발육한다. 핵 전달 난모세포 또는 배아의 적어도 1％, 3％, 5％, 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％ 또는 90％가 생존가능한 자손으로 발육하는 것이 바람직하다. 상기 방법에서, 염색질 덩어리 또는 리프로그래밍된 세포를 함유하는 난모세포를 세포 분열을 허용하는 조건하에 배양할 수 있으며, 생성된 세포 중 하나를 1 회 이상 리클로닝(recloning)할 수 있다. 공여자 핵, 공여자 염색질 덩어리 또는 상기 방법에 사용된 공여자 세포 및 난모세포는 동일 종으로부터 유래되거나 또는 상이한 종 또는 속으로부터 유래될 수 있다. 공여자 세포 또는 생성된 트랜스제닉 유제동물은 상응하는 자연 발생 세포 또는 유제동물보다 적어도 10％, 20％, 40％, 60％, 80％, 90％, 95％ 또는 100％ 덜 기능적인 단백질 또는 전체 단백질을 발현하는 것이 바람직하다. 난모세포는 수정된 것일 수도 있고 미수정된 것일 수도 있다. 공여자 핵, 염색질 덩어리 또는 투과가능해진 세포는 G 1 또는 G 0 기의 세포인 것이 바람직하다. 또한, 클로닝된 배아, 태아 또는 유제동물의 게놈 DNA는 바람직하게는 공여자 세포의 게놈 DNA와 실질적으로 동일하다. 또한, 염색질 덩어리 또는 리프로그래밍된 세포는 상기 염색질 덩어리 또는 리프로그래밍된 세포에서와 실질적으로 동일한 DNA를 갖는 세포 및 배아의 자연 발생 세포에서와 실질적으로 동일한 DNA를 갖는 세포의 혼합물을 함유하는 키메라 배아, 태아 또는 유제동물의 생성을 위한 배아에 삽입시킬 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명의 방법에 핵형성된(nucleated) 난모세포를 사용할 수도 있다고 고려된다.
본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 리프로그래밍 배지는 외인성 뉴클레오티드를 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 리프로그래밍 배지에 있거나 또는 투과가능해진 세포에서 형성되는 염색질 덩어리를 대상 유전자를 코딩하는 핵산을 갖는 벡터와, 벡터내 핵산과 염색질 덩어리의 게놈에서의 상응하는 핵산 사이의 랜덤 통합 또는 상동성 재조합을 허용하는 조건하에 접촉시킴으로써 염색질 덩어리의 게놈을 변경시킨다. 무손상 원형질막의 결여 및 핵막의 결여로 인해, 투과가능해진 세포내의 염색질 덩어리 또는 용액 중의 염색질 덩어리는 자연 발생 세포의 것보다 유전적으로 변형시키기가 보다 용이할 수 있다. 리프로그래밍 추출물 생성에 사용될 수 있는 세포의 예로는 배아 줄기 세포 및 뇌, 혈액, 골수, 췌장, 간, 피부 또는 임의의 다른 기관 또는 조직으로부터의 성체 줄기 세포 등이 있다. 다른 예시적인 리프로그래밍 세포 추출물로는 난모세포 추출물 (예를 들어, 소과 동물 또는 성게 난모세포 추출물) 및 수컷 생식 세포 추출물 (예를 들어, 정조세포, 정모세포, 정자세포 또는 척추동물, 무척추동물 또는 소과 동물과 같은 포유동물로부터의 정자 추출물) 등이 있다. 공여자 또는 투과가능해진 세포는 불멸화되지 않거나 또는 자연적으로, 자발적으로 또는 유전적으로 불멸화될 수 있다. 공여자 세포, 투과가능해진 세포, 수용자 세포 또는 세포질체(cytoplast)는 임의 연령의 공급원, 예를 들어 배아, 태아, 어린 개체 또는 성체 포유동물 (예를 들어, 유제동물)로부터 유래될 수 있다. 더 어린 개체 공급원으로부터의 세포는 자발적 돌연변이가 더 적을 수 있으며, 난모세포로의 삽입 이후에 수명이 더 길 수 있다.
유제동물의 교배 방법
유제동물 또는 유제동물 세포를 생성하는 상기 임의의 방법의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 유제동물을 다른 유제동물 (예를 들어, 항체 중쇄 핵산 또는 경쇄 핵산에 돌연변이를 갖는 유제동물 또는 이종 항체를 코딩하는 핵산을 갖는 유제동물)과 교배하여, 둘 이상의 유전적 변형을 갖는 태아 또는 살아있는 자손을 생성한다. 태아 또는 자손으로부터 1 개 이상의 세포를 단리하고 상기 단리된 세포(들)에 하나 이상의 추가의 유전적 변형을 도입하는 것이 바람직하다.
항체 제조 방법
또한, 본 발명은 이종 항체를 발현하는 본 발명의 유제동물을 사용하여 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 이러한 방법 중 하나는 하나 이상의 대상 항원을, 이종 항체 유전자 로커스를 코딩하는 핵산을 갖는 본 발명의 유제동물에게 투여하는 단계를 포함한다. 유전자 로커스 내의 핵산 절편에서는 재배열이 일어나서 항원에 대해 특이적인 항체가 생성된다. 상기 항체는 유제동물로부터 회수된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 대상 항원에 반응성인 것이 바람직하다. 항체는 유제동물의 혈청 또는 젖으로부터 회수하는 것이 바람직하다.
관련 측면에서, 본 발명은 이종 항체 유전자 로커스를 코딩하는 핵산을 갖는 본 발명의 유제동물로부터 이종 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체를 생산하는 다른 방법을 제공한다. 유전자 로커스 내의 핵산 절편에서는 재배열이 일어나서 이종 항체가 생성된다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 대상 항원에 반응성인 것이 바람직하다. 항체는 유제동물의 혈청 또는 젖으로부터 회수하는 것이 바람직하다.
핵산
또한, 본 발명은 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)의 프리온 유전자를 돌연변이시키는데 유용한 핵산 (예를 들어, 벡터)을 제공한다. 이러한 핵산 중 하나는 5'에서 3'로의 순서로 유제동물 세포의 내인성 프리온 핵산의 제1 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 상동성 영역, 양성 선별 마커 및 상기 프리온 핵산의 제2 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 상동성 영역을 포함하는 카세트를 갖는 것이다. 한 실시양태에서, 제1 상동성 영역 (예를 들어, 3 kb, 2 kb, 1.5 kb 또는 1 kb 미만의 영역)은 제2 상동성 영역 (예를 들어, 7 kb, 8 kb, 9 kb 또는 10 kb 이상의 영역)보다 짧고, 상기 카세트는 세포의 내인성 프리온 핵산에 통합시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 상동성 영역은 제2 상동성 영역보다 길다. 제1 상동성 영역 및(또는) 제2 상동성 영역은 돌연변이될 세포의 내인성 프리온 핵산의 상응하는 영역에 동계유전자(isogenic)인 것이 바람직하다.
관련 측면에서, 본 발명은 유제동물 세포의 내인성 프리온 핵산의 제1 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제1 상동성 영역, 양성 선별 마커 및 상기 프리온 핵산의 제2 영역에 실질적인 서열 동일성을 갖는 제2 상동성 영역 및 양성 선별 마커와는 반대 방향으로 배향된 음성 선별 마커 (예를 들어, DT-A 또는 Tk) (예를 들어, 더 짧은 상동성 영역의 말단에 프로모터가 연결되어 있는 음성 선별 마커)를 포함하는 카세트를 갖는 핵산을 제공한다. 상기 카세트는 세포의 내인성 프리온 핵산에 통합시킬 수 있다. 상동성 영역 중 하나는 길이가 7 kb, 8 kb, 9 kb 또는 10 kb 이상이고, 다른 상동성 영역은 길이가 3 kb, 2 kb, 1.5 kb 또는 1 kb 미만인 것이 바람직하다. 몇몇 실시양태에서, 음성 선별 마커의 일부 또는 전체가 더 짧은 상동성 영역 내에 있다. 제1 상동성 영역 및(또는) 제2 상동성 영역은 돌연변이될 세포의 내인성 프리온 핵산의 상응하는 영역에 동계유전자인 것이 바람직하다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 및 스페르미딘 (예를 들어, 0.1 내지 10 mM 스페르미딘)을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 측면의 바람직한 실시양태
유제동물의 항혈청 또는 젖은 폴리클로날 인간 이뮤노글로불린을 갖는 것이 바람직하다. 상기 항혈청 또는 젖은 소과 동물, 양과 동물, 돼지과 동물 또는 염소과 동물에서 유래된 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, Ig는 목적 항원에 대해 지정된다. 바람직한 실시양태에서, 항혈청은 인간에서 질병의 치료 또는 예방을 위한 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG)으로 사용된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 대상 항원을 유제동물에게 투여하며, 항원에 대해 지정되는 Ig는 상기 유제동물에 의해 생성된다. 이종 이뮤노글로불린 유전자 로커스 내의 핵산 절편이 재배열되며, 대상 항원과 반응성인 이종 항체가 생성되는 것이 바람직하다. 항혈청 및(또는) 젖은 이종 항체를 내인성 항체보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배 또는 50배 더 많이 함유하거나 내인성 항체를 함유하지 않는 것이 바람직하다. 원한다면, 상기 기술한 트랜스제닉 유제동물 (예를 들어, 트랜스제닉 소과 동물)로부터의 이종 B-세포를 사용하여 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 또한, 유제동물로부터 단리된 이종 항체 (예를 들어, 인간 항체)는 이들이 독소, 치료 활성 화합물, 효소, 사이토카인, 방사성표지, 형광 표지 또는 친화성 태그에 공유 결합으로 연결되도록 추후에 화학적으로 변형시킬 수 있음이 고려된다. 원한다면, 항체의 시험관내 또는 생체내 영상화를 위해 형광 표지 또는 방사성표지를 사용할 수 있다.
프리온 핵산 내의 돌연변이는 감염성 형태의 프리온 단백질 생성을 감소시키는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 유제동물에 의해 생성되는 감염성 형태의 프리온 단백질의 양은, 돌연변이가 없는 대조군 유제동물에 의해 생성되는 양의 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 10％ 또는 5％ 미만이다. 감염성 프리온 단백질이 생성되지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 돌연변이는 다른 동물 (예를 들어, 상이한 종 또는 품종의 유제동물)로부터의 프리온 핵산의 일부 또는 전체 (예를 들어, 코딩 영역)의 삽입이다. 상기 이종 프리온 핵산이 내인성 프리온 핵산의 일부 또는 전체를 대체하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이종 프리온 핵산은 프리온 감염에 대한 내성이 증가된 종 또는 품종, 예를 들어 스크라피에 내성이 있는 양으로부터 유래한다. 프리온 감염을 갖는 돌연변이가 있는 유제동물의 비율(％)은 프리온 감염을 갖는 돌연변이가 없는 대조군 유제동물의 비율(％)의 80％, 70％, 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 10％ 또는 5％ 미만인 것이 바람직하다.
바람직한 유제동물 및 공여자 세포
유제동물로는 페리소닥틸라( Perissodactyla ) 및 아르티오닥틸라( Artiodactyla ) 목(order)의 구성원, 예를 들어 보스( Bos ) 속(genus)의 구성원 등이 있다. 다른 바람직한 유제동물로는 양, 빅-혼(big-horn) 양, 염소, 버팔로, 영양, 황소, 말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크, 카리부, 물소, 낙타, 라마, 알파카, 돼지 및 코끼리 등이 있다.
바람직한 공여자 세포로는 분화된 세포, 예를 들어 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각질 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 대식 세포, 단핵 세포, 섬유아세포 및 근육 세포; 및 분화되지 않은 세포, 예를 들어 배아 세포 (예를 들어, 줄기 세포 및 배아 생식 세포) 등이 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 세포는 암컷 생식계, 예를 들어 유선, 난소구(ovarian cumulus), 과립층 또는 난관 세포로부터 유래된다. 다른 바람직한 세포로는 태아 세포 및 태반 세포 등이 있다. 또한, 바람직한 세포로는 임의의 기관, 예를 들어 방광, 뇌, 식도, 나팔관, 심장, 소장, 담낭, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 전립선, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관(trachea), 요관, 요도 및 자궁으로부터의 세포 등이 있다. 공여자 세포, 공여자 핵, 공여자 염색질 덩어리 또는 재구성된 난모세포는 사배체가 아닌 것이 바람직하다.
다른 바람직한 실시양태에서, 핵, 투과가능해진 세포 또는 염색체는 트랜스제닉 세포 또는 유제동물로부터 유래되거나 또는 공여자 세포 또는 자연 발생 세포에서는 발견되지 않는 돌연변이를 함유한다. 바람직한 트랜스제닉 공여자 핵 및 공여자 세포는 클로닝된 유제동물에서 질병 또는 기생충에 대해 향상된 내성을 부여하는 단백질을 코딩한다. 별법으로, 공여자 핵 또는 공여자 세포는 클로닝된 유제동물이 소과 동물의 뇨, 혈액 또는 젖에서의 인간 단백질 제조 등과 같이 재조합 산물을 생산하도록 유전자조작할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 유로플라킨 프로모터의 제어하에 인간 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입함으로써 소의 뇨 중에서 발현시킬 수 있다. 클로닝된 소과 동물의 젖에서 생성될 수 있는 치료 단백질로는 인간 혈액응고 인자, 예를 들어 인자 I 내지 XIII의 임의의 인자 등이 있다 [Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, New York, 1990]. 이들 이종 단백질은 프로락틴 프로모터 또는 소과 동물의 젖에서의 발현에 적합한 임의의 다른 프로모터의 제어하에 발현될 수 있다. 이러한 조직 또는 다른 조직 또는 체액으로부터의 재조합 단백질은 표준 정제 방법을 이용하여 정제할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조).
정의
본원에서 사용된 바와 같이, "인공 염색체"는 선별가능한 마커의 부가, 클로닝 부위의 부가, 1 개 이상의 뉴클레오티드 결실, 1 개 이상의 뉴클레오티드 치환 등과 같은 인공 변형이 일어난 포유동물 염색체 또는 그의 단편을 의미한다. "인간 인공 염색체" 또는 "HAC"는 하나 이상의 인간 염색체(들)로부터 생성된 인공 염색체를 의미한다. 인공 염색체는 숙주 세포에서 숙주 세포의 내인성 염색체와는 독립적으로 유지될 수 있다. 이러한 경우, HAC는 안정하게 복제되어 내인성 염색체와 분리될 수 있다. 별법으로, HAC는 숙주 세포의 내인성 염색체에 전위되거나 그에 삽입될 수 있다. 2 종 이상의 인공 염색체를 동시에 또는 순차적으로 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 염색체 #14 (Ig 중쇄 유전자 포함), 인간 염색체 #2 (Ig 카파 쇄 유전자 포함) 및 인간 염색체 #22 (Ig 람다 쇄 유전자 포함)로부터 유래된 인공 염색체를 도입시킬 수 있다. 별법으로, 이종 Ig 중쇄 유전자 및 Ig 경쇄 유전자, 예컨대 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 둘 다 포함하는 인공 염색체(들)을 도입시킬 수 있다. 중쇄 로커스 및 경쇄 로커스는 상이한 염색체 아암(arm) 상에 (즉, 동원체의 다른 측에) 있는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, HAC의 전체 크기는 대략 10 메가베이스, 9 메가베이스, 8 메가베이스 또는 7 메가베이스 이하이다.
"배열전 핵산 또는 재배열되지 않은 핵산"은 V(D)J 재조합이 일어나지 않은 핵산을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 항체 경쇄의 V 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편은 J 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편으로부터 1 개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있다. 항체 중쇄의 V 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편은 D 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편으로부터 1 개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있고(있거나) 항체 중쇄의 D 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편은 J 유전자 절편을 코딩하는 모든 핵산 절편으로부터 1 개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것이 바람직하다. 재배열되지 않은 형태의 핵산은 실질적으로 인간의 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 인간으로부터의 자연 발생 핵산의 상응하는 영역과 적어도 70％, 80％, 90％, 95％ 또는 99％의 동일성을 갖는다.
"내인성 항체의 양 및(또는) 활성을 감소시키는"은 예를 들어 2003년 5월 19일자로 출원된 미국 제10/441,503호에 기재된 바와 같이 B-세포 또는 B-세포 집단에 의해 생성되는 내인성 기능적 항체의 양을 감소시키는 것을 의미한다. 내인성 항체의 양의 이러한 감소는 B-세포 1 개 당 생성되는 내인성 항체 양의 감소, 기능적 내인성 B-세포 수의 감소 또는 이들의 조합에 기인할 수 있다. 내인성 항체를 발현 또는 분비하는 B-세포에 의해 분비되거나 상기 B-세포의 표면 상에서 발현되는 내인성 항체의 양은 적어도 25％, 50％, 75％, 90％ 또는 95％ 감소되는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 수용자 포유동물로부터의 샘플, 예컨대 혈액 샘플에서 내인성 B-세포의 수는 적어도 25％, 50％, 75％, 90％ 또는 95％ 감소된다.
"이관능성 항체"는 상이한 항체 또는 항체의 상이한 단편에 공유 결합으로 연결된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 의미한다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 항체 또는 단편은 둘 다 동일한 항원에서 발현되는 상이한 에피토프에 결합한다. 다른 바람직한 이관능성 항체는 두가지 상이한 항원, 예컨대 항체 경쇄 및 항체 중쇄 둘 다에 결합한다. 본원에 기재된 것과 같은 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 2 개의 핵산을 작동가능하게 연결시켜 상기 융합 핵산이 이관능성 항체를 코딩하도록 할 수 있다.
"단편"은 본 발명의 항체의 상응하는 영역과 동일하지만 전장 서열보다 짧은 연속적인 아미노산 영역을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 본원에 기재된 것과 같은 표준 분석을 기초로 할 때, 상기 단편은 상응하는 항체와 동일한 항원에 결합하는 능력을 갖는다. 단편과 항원의 결합은 상응하는 항체와 항원의 결합의 20％, 40％, 60％, 80％ 또는 90％ 이상인 것이 바람직하다.
"정제된"은 자연적으로 수반되는 다른 성분으로부터 분리된 것을 의미한다. 전형적으로, 인자는 자연적으로 회합되는 단백질, 항체 및 자연 발생 유기 분자로부터 50 중량％ 이상 유리되었을 때 실질적으로 순수하다. 상기 인자는 75 중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량％ 이상, 가장 바람직하게는 99 중량％ 이상 순수한 것이 바람직하다. 실질적으로 순수한 인자는 화학적 합성, 천연 공급원으로부터의 인자 분리 또는 상기 인자를 자연적으로 생산하지 않는 재조합 숙주 세포에서의 인자 생산에 의해 수득할 수 있다. 단백질, 소포 및 세포소기관은 문헌 [Ausubel et al. (상기 문헌)]에 기재된 것과 같은 표준 기술을 이용하여 당업자에 의해 정제될 수 있다. 상기 인자는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 광학 밀도, HPLC 분석 또는 웨스턴 블롯팅 분석을 이용하여 측정할 때 출발 물질에 비해 2 배, 5 배 또는 10 배 이상 더 순수한 것이 바람직하다 [Ausubel et al. (상기 문헌)]. 바람직한 정제 방법으로는 면역침전, 컬럼 크로마토그래피, 예컨대 면역친화성 크로마토그래피, 자성 비드 면역친화성 정제 및 플레이트 결합된 항체를 사용한 패닝(panning) 등이 있다.
"염색질 덩어리"는 막으로 둘러싸여 있지 않은 1 개 초과의 염색체를 의미한다. 염색질 덩어리는 세포의 모든 염색체를 함유하는 것이 바람직하다. 응축된 염색체를 함유하는 인공적으로 유도된 염색질 덩어리는 본원에 기재된 바와 같이 유사분열 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 유사분열 추출물)에 핵을 노출시켜 형성될 수 있다. 별법으로, 탈응축된 또는 부분 응축된 염색체를 함유하는 인공적으로 유도된 염색질 덩어리는 본원에 기재된 바와 같이 다음 중 하나에 핵을 노출시킴으로써 생성될 수 있다: 항-NuMA 항체를 함유하는 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액. 염색질 덩어리는 물리적으로 서로 접촉하지 않는 별개의 염색체를 함유할 수 있거나, 물리적으로 접촉하는 2 개 이상의 염색체를 함유할 수 있다.
원한다면, 염색체의 응축 수준은 DNA 염색물질인 DAPI를 이용하여 염색 강도를 측정함으로써 표준 방법으로 측정할 수 있다. 염색체가 응축됨에 따라 이러한 염색 강도는 증가한다. 따라서, 염색체의 염색 강도는 간기의 탈응축된 염색체의 염색 강도 (0％ 응축된 것으로 지정) 및 유사분열시의 최대 응축된 염색체의 염색 강도 (100％ 응축된 것으로 지정)와 비교될 수 있다. 이러한 비교를 기초로 하여, 최대 응축율(％)을 결정할 수 있다. 응축된 염색질 덩어리의 바람직한 응축율은 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％이다. 탈응축된 또는 부분 응축된 염색질 덩어리의 바람직한 응축율은 50％, 40％, 30％, 20％ 또는 10％ 미만이다.
"핵"은 세포의 대부분의 DNA 또는 모든 DNA를 함유하는 막-결합된 세포소기관을 의미한다. DNA는 탈응축된 형태로 염색체 내로 팩키징(packaging)된다. DNA를 캡슐화하는 막은 1 또는 2 개의 지질 이중층을 포함하거나 뉴클레오포린을 갖는 것이 바람직하다.
"4 세트 미만의 상동 염색체를 갖는 핵"은 4n 미만의 DNA 함유물을 갖는 핵을 의미하며, 여기서 "n"은 특정 속 또는 종에 속하는 포유동물의 정상적인 반수체 염색체 세트에서 발견되는 염색체의 수이다. 이러한 핵은 각 유전자 또는 유전자 로커스의 카피가 4 개가 아니다. 핵은 이배체이어서 2 세트의 상동 염색체를 갖지만, 완전한 쌍의 염색분체는 2 개 미만인 것이 바람직하다.
"전핵"은 감수분열에 의해 생성된 반수체 핵 또는 핵 전달 전핵을 의미한다. 암컷 전핵은 수컷 전핵과 융합되기 전의 난모세포 또는 난자의 핵이다. 수컷 전핵은 수정시 난모세포 또는 난자에 들어간 후이지만 암컷 전핵과 융합하기 전인 정자 핵이다. 핵 전달 전핵은 공여자 세포, 핵 또는 염색질 덩어리가 난모세포에 도입된 후 형성되는 전핵 (예를 들어, 이배체 전핵)이다. 핵 전달 전핵은 상동 염색체가 4 세트 미만이다.
"공여자 세포"는 핵 또는 염색질 덩어리가 유래되는 세포 또는 투과가능해진 세포를 의미한다.
"투과가능화"는 원형질막에서의 구멍 형성 또는 원형질막의 부분 또는 완전 제거를 의미한다.
"리프로그래밍 배지"는 세포, 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로부터 인자를 제거할 수 있거나 또는 용액으로부터의 인자를 세포, 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로 부가할 수 있는 용액을 의미한다. 인자의 부가 또는 제거는 공여자 세포, 염색질 덩어리 또는 핵에서 또는 리프로그래밍된 염색질 덩어리 또는 핵을 함유하는 세포에서 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 증가 또는 감소시키는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 리프로그래밍 배지 중에서 투과가능해진 세포, 염색질 덩어리 또는 핵을 인큐베이션하는 것은 공여자 세포의 표현형에 비해 투과가능해진 세포의 표현형 또는 리프로그래밍된 염색질 덩어리 또는 핵을 함유하는 세포의 표현형을 변경시킨다. 다른 실시양태에서는, 리프로그래밍 배지 중에서 투과가능해진 세포, 염색질 덩어리 또는 핵을 인큐베이션함으로써, 투과가능해진 세포 또는 리프로그래밍된 염색질 덩어리 또는 핵을 함유하는 세포가 공여자 세포에 비해 활성을 얻거나 소실하게 만든다.
리프로그래밍 배지의 예로는 단백질 또는 핵산과 같은 생물학적 분자를 함유하지 않은 용액, 예컨대 완충액 등이 있다. 이러한 용액은 핵, 염색질 덩어리 또는 염색체로부터 하나 이상의 인자를 제거하는 데 유용하다. 다른 바람직한 리프로그래밍 배지는 세포 핵, 세포질 또는 이들의 조합물로부터의 세포 추출물과 같은 추출물이다. 세포 추출물의 예로는 난모세포 (예를 들어, 포유동물, 척추동물 또는 무척추동물의 난모세포), 수컷 생식 세포 (포유동물, 척추동물 또는 무척추동물 생식 세포, 예컨대 정원세포, 정모세포, 정자세포 또는 정자) 및 줄기 세포 (예를 들어, 성체 또는 배아 줄기 세포)로부터의 추출물 등이 있다. 다른 리프로그래밍 배지는 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합 인자 (예를 들어, 핵산 또는 단백질, 예컨대 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성자, 리프레서, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 사이토카인 또는 다른 호르몬)가 첨가된 용액 또는 추출물 또는 하나 이상의 인자가 제거된 추출물이다. 다른 리프로그래밍 배지로는 디터전트 (예를 들어, 0.01％ 내지 0.1％, 0.1％ 내지 0.5％ 또는 0.5％ 내지 2％ 이온성 또는 비이온성 디터전트, 예컨대 하나 이상의 하기 디터전트: SDS, 트리톤(Triton) X-100, 트리톤 X-114, CHAPS, Na-데옥시콜레이트, n-옥틸 글루코시드, 노니뎃(Nonidet) P40, IGEPAL, 트윈(Tween) 20, 트윈 40 또는 트윈 80), 염 (예를 들어, 약 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5 또는 2 M NaCl 또는 KCl), 폴리아민 (예를 들어, 약 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM 또는 10 mM 스페르민, 스페르미딘, 프로타민 또는 폴리-L-리신), 단백질 키나제 (예를 들어, 사이클린-의존성 키나제 1, 단백질 키나제 C, 단백질 키나제 A, MAP 키나제, 칼슘/칼모듈린-의존성 키나제, CK1 카세인 키나제 또는 CK2 카세인 키나제) 및(또는) 포스파타제 억제제 (예를 들어, 약 10 μM, 100 μM, 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM의 하나 이상의 � ��기 억제제: Na-오르토바나데이트, Na-피로포스페이트, Na-플루오라이드, NIPP1, 억제제 2, PNUTS, SDS22, AKAP149 또는 오카다산)의 용액 등이 있다. 몇몇 실시양태에서, 리프로그래밍 배지는 항-NuMA 항체를 함유한다. 원한다면, 다중 리프로그래밍 배지를 동시에 또는 순차적으로 사용하여 공여자 세포, 핵 또는 염색질 덩어리를 리프로그래밍할 수 있다.
"간기 리프로그래밍 배지"는 염색질 탈응축 및 핵 외피 형성을 유도하는 배지 (예를 들어, 간기 세포 추출물)를 의미한다.
"유사분열 리프로그래밍 배지"는 염색질 응축 및 핵 외피 파괴를 유도하는 배지 (예를 들어, 유사분열 세포 추출물)를 의미한다.
"리프로그래밍된 세포"는 리프로그래밍 배지에 노출된 세포를 의미한다. 적어도 1 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 50 개, 75 개, 100 개, 150 개, 200 개, 300 개 또는 그 이상의 mRNA 또는 단백질 분자가 리프로그래밍된 세포에서는 발현되고 공여자 또는 투과가능해진 세포에서는 발현되지 않는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 공여자 또는 투과가능해진 세포에서는 발현되지 않으나 리프로그래밍된 세포에서 발현되는 mRNA 또는 단백질 분자의 수는 예를 들어 1 내지 5 개, 5 내지 10 개, 10 내지 25 개, 25 내지 50 개, 50 내지 75 개, 75 내지 100 개, 100 내지 150 개, 150 내지 200 개 또는 200 내지 300 개이다. 적어도 1 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 50 개, 75 개, 100 개, 150 개, 200 개, 300 개 또는 그 이상의 mRNA 또는 단백질 분자가 공여자 또는 투과가능해진 세포에서는 발현되나 리프로그래밍된 세포에서는 발현되지 않는 것이 바람직하다. 다른 바람직한 실시양태에서, 공여자 또는 투과가능해진 세포에서는 발현되나 리프로그래밍된 세포에서는 발현되지 않는 mRNA 또는 단백질 분자의 수는 예를 들어 1 내지 5 개, 5 내지 10 개, 10 내지 25 개, 25 내지 50 개, 50 내지 75 개, 75 내지 100 개, 100 내지 150 개, 150 내지 200 개 또는 200 내지 300 개이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 이들 mRNA 또는 단백질 분자는 공여자 세포 (즉, 공여자 또는 투과가능해진 출발 세포) 및 리프로그래밍된 세포 둘 다에서 발현되지만 이들 세포에서의 발현 수준은 표준 분석법 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조)을 이용하여 측정하였을 때 적어도 2 배, 5 배, 10 배 또는 20 배 차이가 난다.
"인자의 부가"는 인자가 염색질, 염색체 또는 핵 외피 성분, 예컨대 핵막 또는 핵 매트릭스에 결합하는 것을 의미한다. 별법으로, 인자는 핵에 들어가서 핵 외피에 의해 결합되거나 캡슐화된다. 염색체에 결합되거나 핵에 위치하는 인자의 양은 적어도 25％, 50％, 75％, 100％, 200％ 또는 500％ 증가하는 것이 바람직하다.
"인자의 제거"는 인자가 염색질, 염색체 또는 핵 외피 성분, 예컨대 핵막 또는 핵 매트릭스로부터 분리되는 것을 의미한다. 별법으로, 인자는 핵으로부터 나와서 더이상 핵 외피에 의해 결합되거나 캡슐화되지 않는다. 염색체에 결합되거나 핵에 위치하는 인자의 양은 적어도 25％, 50％, 75％, 100％, 200％ 또는 500％ 감소하는 것이 바람직하다.
"인자의 풍부화 또는 고갈"은 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)에 원래 존재하던 인자 양의 적어도 20％, 40％, 60％, 80％ 또는 100％ 만큼 천연 또는 재조합 인자가 부가 또는 제거되는 것을 의미한다. 별법으로, 리프로그래밍 배지에 자연적으로는 존재하지 않는 천연 또는 재조합 인자가 부가될 수 있다. 바람직한 인자로는 단백질, 예컨대 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵막, 전사 인자, 활성자 및 리프레서; 막 소포 및 세포소기관 등이 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 인자는 하기 기재되는 바와 같이 리프로그래밍 배지에 부가되기 전에 정제된다. 별법으로, 하기 기재된 정제 방법 중 하나를 이용하여 리프로그래밍 배지로부터 원치않는 인자를 제거할 수 있다.
"리클로닝되는"은 제2 라운드의 클로닝에 사용되는 것을 의미한다. 특히, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 배아, 태아 또는 성체로부터의 세포를 유사분열 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 유사분열 세포 추출물)에서 인큐베이션하여, 상기 기재된 바와 같이 핵제거된 난모세포로의 삽입을 위한 염색질 덩어리를 형성할 수 있다. 별법으로, 상기 세포는 상기 기재된 바와 같이 투과가능해지고, 리프로그래밍 배지 중에서 인큐베이션되고, 핵제거된 난모세포로 삽입될 수 있다. 2 회 이상 라운드의 클로닝을 수행하여 공여자 염색질 덩어리 또는 공여자 세포를 추가로 리프로그래밍할 수 있으며, 이로써 마지막 라운드의 클로닝 후 생존가능한 자손의 생성 기회를 증가시킬 수 있다.
"생존가능한 자손"은 자궁외에서 살아남는 포유동물을 의미한다. 포유동물은 모계 숙주로부터 나온 시점으로부터 적어도 1 초, 1 분, 1 시간, 1 일, 1 주, 1 개월, 6 개월 또는 1 년 동안 생존하는 것이 바람직하다. 포유동물은 생존을 위해 자궁내 환경의 순환 시스템을 필요로 하지 않는다.
"핵 전달 난모세포" 또는 "핵 이식 난모세포"는 공여자 세포, 핵 또는 염색질 덩어리가 삽입되거나 융합된 난모세포를 의미한다. 상기 난모세포로부터 형성된 배아는 "핵 전달" 또는 "핵 이식" 배아로 지칭된다.
"배아" 또는 "배아의"는 모계 숙주의 자궁막으로 이식되지 않은 발생하는 세포 덩어리를 의미한다. 따라서, 용어 "배아"는 수정된 난모세포; 공여자 염색질 덩어리, 핵 또는 리프로그래밍된 세포를 함유하는 난모세포; 포배전 단계의 발생하는 세포 덩어리; 또는 모계 숙주의 자궁막으로 이식되기 전 및 생식 융기 형성 전의 발생 단계에 있는 발생하는 임의의 다른 세포 덩어리일 수 있다. 배아는 여러 단계의 세포 발생을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 하나의 세포 배아는 접합자라고 지칭될 수 있고, 분할된 배아로부터 생성된 고상의 구형 세포 덩어리는 상실배라고 지칭될 수 있고, 할강을 갖는 배아는 포배라고 지칭될 수 있다. "배아 세포"는 배아로부터 단리되거나 배아에 함유된 세포이다.
"배아로부터 유래된 세포"는 배아에서 세포 분열에 의해 생성되는 세포를 의미한다.
"키메라 배아"는 2 개 이상의 배아로부터 유래된 세포로부터 형성된 배아를 의미한다. 생성된 태아 또는 자손은 오직 1 개의 개시 배아로부터 유래된 세포 또는 1 개 초과의 개시 배아로부터 유래된 세포를 가질 수 있다. 원한다면, 태반 조직 및 태아 조직으로 혼입된 각 배아로부터 형성된 세포의 비율(％)은 표준 FISH 분석 또는 한 배아에 첨가된 막 염료의 분석을 이용하여 측정할 수 있다.
"키메라 유제동물"은 2 개 이상의 배아로부터 유래된 세포로부터 형성된 유제동물을 의미한다. 유제동물은 오직 1 개의 개시 배아로부터 유래된 세포 또는 1 개 초과의 개시 배아로부터 유래된 세포를 가질 수 있다. 원한다면, 태반 조직 및 태아 조직으로 혼입된 각 배아로부터 형성된 세포의 비율(％)은 표준 FISH 분석 또는 한 배아에 첨가된 막 염료의 분석을 이용하여 측정할 수 있다.
"밀집전(precompaction) 배아"는 밀집 이전의 배아를 의미한다. 본질적으로, 밀집전 배아는 할구 표면에서 E-카드헤린을 발현하지 않는다. 바람직한 밀집전 배아는 동일한 종의 완전 밀집된 배아에 비해 E-카드헤린을 적어도 3 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배 또는 40 배 적게 발현하거나, E-카드헤린을 전혀 발현하지 않는다.
"밀집 배아"는 밀집이 이루어지고 있거나 밀집이 일어난 배아를 의미한다. 밀집 배아의 할구는 그의 표면에서 E-카드헤린을 발현한다. 상기 E-카드헤린 발현은 항-E-카드헤린 항체를 이용하는 표준 방법으로 측정할 수 있다. E-카드헤린은 할구들 사이의 부착을 증가시킨다. 바람직한 밀집 배아로는 밀집 과정이 완료된 배아 등이 있다. 다른 바람직한 밀집 배아는 동일한 종의 밀집전 배아에 비해 E-카드헤린을 적어도 3 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배 또는 40 배 많이 발현한다.
"태아"는 모계 숙주의 자궁막에 이식된 발생하는 세포 덩어리를 의미한다. 태아는 당업자에게 용이하게 인식되는 생식 융기와 같이 규정된 특징을 가질 수 있다. "태아 세포"는 태아로부터 단리되거나 태아에 함유된 임의의 세포이다.
"단성생식" 또는 "단성생식 활성화"는 난모세포 또는 난자의 핵과 수컷 전핵의 융합이 없이 난모세포 또는 난자가 발생하여 접합자를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들어, 난모세포는 수정없이도 분할이 유도될 수 있다.
"투명대"는 여러 포유동물의 난모세포 또는 난자를 둘러싸는 반투명한 탄력성 무세포층을 의미한다.
"영양외배엽"은 포유동물 태아 발생의 포배 단계 동안 할강을 둘러싸는 세포의 최외층을 의미한다. 영양외배엽은 추가의 발생시에 대부분의 또는 모든 태반 조직을 형성한다.
"내부 세포 덩어리"는 영양외배엽에 의해 둘러싸인 세포를 의미한다. 내부 세포 덩어리 세포는 추가의 발생시에 대부분의 태아 조직을 형성한다.
"한 세포 유형에 대해 특이적인 mRNA 또는 단백질"은 모든 다른 세포 유형에서의 발현 수준에 비해 적어도 10 배, 20 배, 50 배, 75 배 또는 100 배 높은 수준으로 어떤 한 세포 유형에서 발현되는 mRNA 또는 단백질을 의미한다. mRNA 또는 단백질은 한 세포 유형에서만 발현되는 것이 바람직하다.
"돌연변이"는 천연 또는 기준 핵산 서열에서의 변경, 예컨대 삽입, 결실, 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이, 사일런트(silent) 돌연변이, 넌센스 돌연변이 또는 미스센스 돌연변이를 의미한다. 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 천연 서열로부터 1 개 이상의 아미노산이 변경되는 것이 바람직하다. 세포, 배아, 태아 또는 포유동물의 게놈 서열을 변경하기 위한 재조합 DNA 기술의 예로는 다른 유기체 (예를 들어, 인간)으로부터의 DNA 서열을 상기 게놈으로 삽입하는 것, 1 개 이상의 DNA 서열을 결실시키는 것 및 1 개 이상의 염기 돌연변이 (예를 들어, 부위-지정 또는 랜덤 돌연변이)를 표적 DNA 서열에 도입시키는 것 등이 있다. 이러한 변형을 이루기 위한 방법의 예로는 레트로바이러스 삽입, 인공 염색체 기술, 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터를 이용한 랜덤 삽입, 상동성 재조합, 유전자 표적화, 전위가능한 요소 및 외래 DNA를 도입시키는 임의의 다른 방법 등이 있다. 이들 모든 기술은 분자 생물학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조). 변형된 DNA를 함유하는 트랜스제닉 세포 또는 공여자 트랜스제닉 세포로부터의 염색질 덩어리, 염색체 및 핵은 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
"불멸화"는 불멸화 세포와 동일한 세포 유형, 속 및 종인 천연 대조군 세포에 비해 또는 불멸화 세포가 유래되는 공여자 세포에 비해 적어도 25％, 50％, 75％, 90％ 또는 95％ 더 많이 세포 분열을 수행할 수 있는 것을 의미한다. 불멸화 세포는 대조군 세포에 비해 적어도 2 배, 5 배, 10 배 또는 20 배 더 많이 세포 분열을 수행할 수 있는 것이 바람직하다. 불멸화 세포는 비제한적인 횟수로 세포 분열을 수행할 수 있는 것이 더욱 바람직하다. 불멸화 세포로는 그들의 정상적인 성장-조절 과정을 변경시키는 돌연변이를 생체내 또는 시험관내에서 자연적으로 획득한 세포 등이 있다. 다른 바람직한 불멸화 세포의 예로는 종양유전자, 예컨대 ras, myc, abl, bcl2 또는 neu를 발현하도록 유전적으로 변형된 세포 또는 형질변형 DNA 또는 RNA 바이러스, 예컨대 엡스테인 바(Epstein Barr) 바이러스 또는 SV40 바이러스로 감염된 세포 등이 있다. (문헌 [Kumar et al., Immunol. Lett. 65:153-159, 1999], [Knight et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988], [Shammah et al., J. Immunol. Methods 160-19-25, 1993], [Gustafsson and Hinkula, Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994], [Kataoka et al., Differentiation 62:201-211, 1997], [Chatelut et al., Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998]). 세포는 또한 텔로머라제 유전자를 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다 (문헌 [Roques et al., Cancer Res. 61:8405-8507, 2001]).
"비불멸화"는 상기 기재된 바와 같이 불멸화되지 않은 것을 의미한다.
"융합발생 화합물"은 염색질 덩어리 또는 핵이 수용자 세포에 인접하게 위치할 때 상기 세포에 삽입되는 가능성을 증가시키는 화합물을 의미한다. 예를 들어, 융합발생 화합물은 세포의 원형질막에 대한 염색질 덩어리 또는 핵의 친화성을 증가시킬 수 있다. 융합발생 화합물은 또한 핵의 핵막과 세포의 원형질막의 결합을 촉진시킬 수도 있다.
"실질적으로 동일한"은 다른 서열과 적어도 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 것을 의미한다. 전형적으로, 서열 동일성은 디폴트 파라미터가 명시되어 있는 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 서열 분석 소프트웨어 팩키지, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 미국 53705 위스콘신주 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터 소재)를 이용하여 측정한다. 상기 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 대한 상동성 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매칭시킨다.
이점
본 발명은 프리온 유전자의 대립유전자 1 개 또는 둘 다에 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)의 생성과 관련된 수많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 본원에 기재한 바와 같은 프리온 녹아웃 벡터, 세포 배양 방법 및 형질감염 방법은 소과 동물 세포의 프리온 유전자를 놀랄만큼 높은 빈도로 불활성화시켰다. 정확하게 표적화된 수많은 공여자 세포 및 본 발명의 개선된 핵 전달 방법 (예를 들어, 염색질 전달 및 SLOT)의 조합은, 프리온 단백질의 발현이 줄어들거나 프리온 단백질이 발현되지 않는 클로닝된 트랜스제닉 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)의 생성을 크게 용이하게 한다. 생성된 이들 트랜스제닉 유제동물은 농업 제품 (예를 들어, 육류) 및 제약 제품 (예를 들어, 트랜스제닉 유제동물에서 1 종 이상의 이종 핵산에 의해 코딩되는 인간 치료 항체)의 바람직한 공급원이다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위로부터 명백해 질 것이다.
본 출원 파일은 컬러로 도시된 도면 (도 31, 34A 내지 34C, 36A, 36B 및 42A 내지 42D, 45A, 46D, 47A, 47C, 48, 49B, 50A 내지 50D 및 51C 내지 51E))를 포함한다. 컬러 도면을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 요청하여 필요 요금을 납부할 때 특허청으로부터 제공될 것이다.
도 1A는 Ig 녹아웃 및 인간 인공 염색체를 함유하는 암소를 생산하는데 이용된 절차의 개요도이다. 도 1A에서 시간 라인은 Ig 녹아웃 벡터를 제조하고 녹아웃 세포를 생성하기 위한 18 개월, 녹아웃 세포로부터 태아를 생성시키기 위한 2 개월, 후속적인 녹아웃을 수행하기 위한 9 개월, 송아지가 태어나기까지의 임신 기간 9 개월, 배아가 송아지로부터 생성될 수 있을 때까지의 12 개월 및 HAC 전달을 수행하기 수행하기 위한 6 개월이라고 추정되는 시간을 기준으로 한다.
도 1B는 내인성 Ig 유전자에 돌연변이를 함유하고 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 함유하는 암소를 생성하는데 이용된 방법의 개요도이다. 도 1B에서의 시간 라인의 경우, 매주 250 개씩의 콜로니를 스크리닝하여 3 개월 동안 총 3,000 개 콜로니를 스크리닝하여, 수컷 및 암컷 녹아웃 세포를 단리한 것으로 추정하였다. 1,500 개 콜로니 당 1 개 이상의 녹아웃 콜로니가 생성되는 것으로 가정하였다. 동종접합성 녹아웃 유제동물은 (1) 핵 전달 이전에 단리된 녹아웃 세포에서 제2 Ig 돌연변이를 도입시키거나, (2) 배아, 태아 (예를 들어, 임신 일수 약 60 일의 태아) 또는 제1 라운드 핵 전달로부터 생성되고 생성된 동종접합성 세포를 제2 라운드의 핵 전달시에 공여자 세포로서 이용하여 수득한 자손으로부터 얻은 세포에 제2 Ig 돌연변이를 도입시키거나, 또는 (3) 반접합성 유제동물을 교배하여 생산할 수 있다. 도 1A 및 1B에서, "호모(hom*o)"는 동종접합자를 의미하고, "헤미(Hemi)"는 반접합자를 의미하고, "H"는 중쇄를 의미하고, "L"은 경쇄를 의미하고, "HAC"는 인간 인공 염색체를 의미하고, "HAC 1"는 임의의 HAC을 의미하고, "HAC2"는 제2 HAC를 의미한다.
도 2A는 본 발명에 따른 뮤 (IgM 중쇄) 녹아웃 구조물을 도시한다. 도 2B는 홀스타인(Holstein) 소로부터 얻은 이뮤노글로불린 로커스의 제한효소 지도이다.
도 3A 및 3B는 구조물 "pSTneoB" 및 "pLoxP-StneoB"의 개략도이다. 이들은 각각 뮤 녹아웃 DNA 구조물을 제조하는데 사용되었다.
도 3C는 뮤 녹아웃 DNA 구조물을 도시한다.
도 3D는 상기 뮤 녹아웃 구조물에서 제1 상동성 영역으로 사용된 게놈 소과 동물 뮤 중쇄 로커스의 1.5 kb 영역의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 47)을 도시한다.
도 3E는 상기 뮤 녹아웃 구조물의 제2 상동성 영역으로 사용된 게놈 소과 동물 뮤 중쇄 로커스의 3.1 kb 영역의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 48)을 도시한다. 상기 서열에서, 각각의 "n"은 임의의 뉴클레오티드를 나타내거나, 뉴클레오티드가 없음을 나타낸다. 연속적인 "n" 뉴클레오티드 영역은 폴리뉴클레오티드 서열이 결정되지 않은 대략 0.9 내지 1.0 kb 영역을 나타낸다.
도 3F는 퓨로마이신에 내성이 있는, 소과 동물 뮤 중쇄 녹아웃 구조물을 도시한다.
도 3G는 소과 동물 카파 경쇄 cDNA의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 60)을 도시한다. 상기 서열의 전체 또는 일부는 카파 경쇄 녹아웃 구조물에서 사용될 수 있다. 또한, 상기 카파 경쇄는 카파 경쇄 녹아웃 구조물에서 사용하기 위한 게놈 카파 경쇄 서열을 단리하는데 사용될 수 있다.
도 4는 ΔHAC 및 ΔΔHAC 제조를 위한 예시적 개략도이다.
도 5는 ΔHAC 태아에서 인간 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 게놈 DNA의 존재를 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 6은 임신 일수 77일의 ΔHAC 태아 (태아 #5996)에서 인간 Cmu 엑손 3 및 4의 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 7은 ΔHAC 태아 #5996에서 내인성 소과 동물 중쇄의 재배열을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 8은 ΔHAC 태아 #5996에서 재배열된 인간 중쇄의 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 9는 ΔHAC 태아 #5996에서 인간 중쇄 로커스로부터의 스플라이싱된 불변 영역의 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 10은 ΔHAC 태아 #5996에서 재배열된 인간 중쇄의 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 11A는 ΔHAC 태아 #5996로부터의 재배열된 인간 중쇄 전사체의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 49)이다.
도 11B는 인간 항-폐렴구균 항체 ("Sbjct")를 갖는 상기 서열 영역 ("문의(Query)")의 서열 정렬이다 (각각 서열 50 및 51). ΔHAC 태아 #5996로부터의 문의 서열의 경우, 인간 항-폐렴구균 항체 서열의 상응하는 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드만을 도시하였다.
도 12A 및 도 12B는 ΔHAC 태아 #5996으로부터의 재배열된 인간 중쇄 전사체에 대한 추가의 2 개 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 52 및 54) 및 이들의 추정 아미노산 서열 (각각 서열 53 및 55)을 나타낸다.
도 13은 ΔΔHAC 태아 #5580이 인간 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 로커스를 둘 다 함유한다는 것을 입증하는 아가로스 겔 사진이다.
도 14는 ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B가 인간 중쇄 및 경쇄 로커스를 둘 다 함유한다는 것을 입증하는 아가로스 겔 사진이다.
도 15는 ΔΔHAC 태아 #5542A에서 인간 중쇄 로커스로부터의 스플라이싱된 뮤 불변 영역의 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 16은 ΔΔHAC 태아 #5868A에서 인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 17은 ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B에서 인간 Ig 람다 로커스의 재배열 및 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 18은 ΔΔHAC 태아 #5442A에서 인간 Ig 람다 로커스의 재배열 및 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 19는 ΔΔHAC 태아 #5868A에서 인간 Ig 람다 로커스의 재배열 및 발현을 보여주는 아가로스 겔 사진이다.
도 20은 ΔΔHAC 태아 #5442A로부터의 재배열된 인간 경쇄 전사체의 폴리뉴클레오티드 서열 및 상응하는 추정 아미노산 서열 (각각 서열 56 및 57)을 도시한다.
도 21은 ΔΔHAC 태아 #5442A로부터의 재배열된 인간 경쇄 전사체의 다른 폴리뉴클레오티드 서열 및 상응하는 추정 아미노산 서열이다 (각각 서열 58 및 59)을 도시한다.
도 22A 내지 도 22H는 ΔΔHAC 태아 #5442A (도 22A 내지 22D) 및 5442B (도 22E 내지 22H)에 의한 인간 람다 경쇄 및 소과 동물 중쇄 단백질 발현의 FACS 분석 그래프이다. 이들 태아의 비장으로부터 얻은 림프구를 피코에리테린 표지된 항-인간 람다 항체 (도 22C 및 22D) 또는 FITC 표지된 항-소과 동물 IgM 항체 (도 22D 및 22H)와 반응시키거나 항체와 반응시키지 않은 (도 22A, 22B, 22E 및 22F) 후에 FASCalibur 세포 분류기 상에서 분석하였다. 상기 항체 중 하나로 표지된 세포의 비율(％)을 각각의 히스토그램 아래에 표시하였다.
도 23은 소과 동물 세포내의 내인성 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 퓨로마이신 내성 유전자 및 전사 종결 서열을 삽입하는데 사용된 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 벡터의 개략도이다.
도 24는 AAV 표적화 벡터의 주쇄로 사용된 엑손 2, 3 및 4를 함유하는 BamHI-XhoI 단편의 개략도이다. 네오마이신 내성 마커를, 엑손 4로 삽입하는 로커스의 삽입성 돌연변이유발에 사용하였다. 이어서, 적절한 표적화 여부의 후속 확인에 사용된 PCR 프라이머의 어닐링 부위의 위치를 표시하였다.
도 25는 내인성 소과 동물 IgH 서열을 제거하기 위해 고안된 아데노-관련 바이러스 구조물의 제조를 위한 개략도이다.
도 26은 적절한 표적화를 위해 개별적으로 형질도입된 클론의 PCR 분석을 보여주는 아가로스 겔 사진이다. 상기 실험에 사용된 벡터는 도 25에 나타내었다. 적절한 표적화를 보여주는 PCR 생성물을 별표 (*)로 표시하였다.
도 27은 HAC를 갖는 배아의 임신율을 열거한 표이다.
도 28A 내지 28J는 B-세포 발생을 저해하기 위해 항-소과 동물 IgM 항체 (das6)를 주입한 실험용 태아 또는 대조군 태아로부터의 말초혈 림프구의 FACS 분석 사진이다. 도 28A 내지 28E는 항-소과 동물 IgM 항체를 사용하여 B-세포 표면에 발현된 IgM 분자를 검출하기 위해 실시한 FACS 분석 사진이다. 도 28A 및 도 2B에 예시한 바와 같이, 대조군 태아로부터의 말초혈 림프구의 대략 19.82％ 내지 26.61％가 IgM을 발현하였다. 대조적으로, 항-소과 동물 IgM 항체를 주입한 3 개의 태아로부터의 말초혈 림프구의 7.78％, 11.80％ 또는 3.95％가 IgM을 발현하였다 (각각 도 28C 내지 28E). 도 28F 내지 28J는 항-소과 동물 경쇄 항체 (das10)를 사용하여 B-세포 표면에 발현된 항체 경쇄 분자를 검출하기 위해 실시한 FACS 분석 사진이다. 도 28F 및 도 28J에 예시한 바와 같이, 대조군 태아로부터의 말초혈 림프구의 대략 12.43％ 내지 29.47％가 항체 경쇄 분자를 발현하였다. 대조적으로, 항-소과 동물 IgM 항체를 주입한 3 개의 태아로부터의 말초혈 림프구의 2.54％, 13.77％ 또는 3.99％가 항체 경쇄 분자를 발현하였다 (각각 도 28H 내지 28J).
도 29A 및 29B는 소과 동물 착상전 배아에서의 핵 외피 및 핵 매트릭스 단백질의 면역검출을 예시한다. 도 29A는 동일한 항체를 사용하여 검사한 전핵 및 8 세포기의 시험관내 수정된 소과 동물 배아의 사진이다. 도 29A의 화살표는 전핵 단계 배아의 암컷 전핵에서 항-NuMA 및 항-AKAP95 표지를 가리킨다. 도 29A의 삽입도는 0.1 ㎍/ml 획스트(Hoechst) 33342 (막대, 20 ㎛)로 표지된 DNA 사진이다. 도 29B는 소과 동물 섬유아세포 (위) 및 전핵 단계 배아 (아래)의 이뮤노블롯팅 분석이다. 분자량 마커는 kDa 단위로 도 29B 우측에 나타냈다.
도 30은 본원에 기재된 바와 같이 활성화된 소과 동물 공여자 섬유아세포 (공여자 세포), 미성숙 염색질 응축 단계 (융합 후 3 시간)의 핵 이식 배아, 전핵 단계 (융합 후 19 시간)의 핵 이식 배아 및 단성생식 전핵 단계 배아의 사진이다. 항-라민 B, 라민 A/C, NuMA 및 AKAP95 항체를 사용하여 공여자 핵의 해리 및 새로운 전핵의 조립을 3 주입 후 시간 "hpi(hours post injection)" ("PCC") 및 7 주입 후 시간 ("NT PN")의 미성숙 염색질 응축 단계에서 모니터링하였다. 10 mM SrCl 2 에 의한 MII 난모세포의 단성생식 활성화 이후에 형성된 암컷 전핵 또한 활성화 처리를 개시한지 5 시간 후에 분석하였다 ("단성생식 PN"). 라민 A/C는 소과 동물 전핵 단계 핵 이식 배아의 전핵에서 조립되었다. DNA를 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 대조염색하였다. TRITC는 TRITC-접합된 2차 항체로 표지한 것을 지칭한다 (막대, 20 ㎛).
도 31은 AKAP95가 단성생식 배아보다 핵 이식 배아의 전핵에서 더 강하게 고정됨을 입증하는 그래프이다. 상기 그래프는 실온에서 0.1％ 트리톤 X-100 및 1 mg/ml DNAse I 및 100 또는 300 mM NaCl로 30 분 동안 원위치 추출한 후 3％ 파라포름알데히드로 고정한 후에 단성생식체, 핵 이식 배아 및 체세포 공여자 핵의 전핵에서 미추출된 라민 B, AKAP95 및 DNA 표지의 상대적 비율을 나타낸다. B-유형 라민 (적색) 및 AKAP95 (녹색)의 국소화를 이중 면역형광으로 검사하였다. 각각의 채널-적색 (라민 B), 청색 (DNA) 및 녹색 (AKAP95)-에서 형광 표지의 강도를 정량하였다. 기준값 (100％ 미추출)은 고정하기 전에 0.1％ 트리톤 X-100으로만 투과가능해진 배아 또는 세포에서 B-유형 라민, DNA 및 AKAP95 염색의 상대량을 나타낸다. 그룹 당 대략 30 개의 배아를 검사하였다.
도 32는 5 μM 이오노마이신을 4 분 동안 사용한 후에 10 ㎍/ml 시클로헥스이미드/2.5 ㎍/ml 사이토칼라신 D를 4 시간 동안 사용하고 (b', -), 이오노마이신/시클로헥스이미드/사이토칼라신 D를 사용 (b')한 후에 10 ㎍/ml 시클로헥스이미드를 사용하여 추가로 9 시간 동안 활성화시키거나 (b", CHX), 또는 (b')와 같이 인큐베이션하되 전체 활성화 처리 동안에 1 ㎍/ml 악티노마이신 D를 첨가 (b''')한 섬유아세포 융합 및 난모세포 활성화에 의해 생산된 소과 동물 전핵 핵 이식 배아의 사진이다. 항-라민 B (토끼 폴리클로날) 및 항-라민 A/C (mAb) 항체를 동일 시료에 사용하였다. 삽입도는 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 표지한 DNA 사진이다 (막대, 20 ㎛).
도 33은 유사분열 세포질 추출물 (M-S15), 유사분열 세포액 추출물 (M-S200) 및 난모세포 추출물 (MII-S15)에서의 염색체 응축 및 핵 외피 파괴의 그래프이다 (3 회 내지 5 회의 반복 실험에서 n = 300 내지 400 개의 핵을 검사함)
도 34A 내지 34C는 정제된 투입 소과 동물 섬유아세포 핵 (도 34A) 및 유사분열 세포질 추출물에서 생산된 응축된 염색질 (도 34B) 및 난모세포 추출물 (도 34C)의 면역형광 분석 사진이다. 표시된 핵 마커를 검사하였다. DNA를 요오드화프로피듐 (적색)으로 대조염색하였다 (막대, 10 ㎛).
도 35는 통상적인 핵 이식 (NT) 또는 핵 주입 (NI) 방법을 수행한 후에 난모세포에서 수득한 응축된 염색질 및 본 발명의 방법을 이용하여 난모세포 (CT)에 주입한 염색질 덩어리의 면역형광 분석 사진이다. 검출가능한 라민 B 및 A/C는 둘 다 용해된 것으로 보인다 (막대, 10 ㎛).
도 36A 및 36B는 염색질 전달, 핵 이식 또는 핵 주입을 수행한 전핵에 대한 일련의 면역형광 분석 사진이다. 핵 이식, 핵 주입 또는 염색질 전달 후 19 시간째에 배아를 고정하고 표지하였다. 대조군 단성생식 전핵 (Part.)도 또한 검사하였다. 도 36A는 라민 A/C 및 B의 분석을 나타낸다. 도 36B는 AKAP95 및 NuMA의 분석을 보여준다. 라민 A/C (녹색 표지)는 핵 이식 및 핵 주입 전핵에서만 나타난다 (막대, 30 ㎛).
도 37은 클로닝된 Tc 송아지를 생산하는 절차의 개략도이다. HAC의 구조는 Igλ 및 IgH 유전자를 함유하는 hChr22 및 hChr14 영역 및 neo 선별 마커의 위치를 사용하여 나타냈다. CHO 클론으로부터, MMCT 기술에 의해 HAC를 소과 동물 태아 섬유아세포에 전달하였다. 핵 전달을 위해 Tc 섬유아세포를 핵제거된 난모세포와 융합하였다. 재구성된 Tc 배아를 포배 단계로 시험관내 배양한 후에, 수용자 암소에게 이식하였다. 임신 제60일 정도에 Tc 태아를 회수하고, 섬유아세포 세포주를 재확립하여 평가하고, 추가의 핵 전달에 사용하였다. 리클로닝된 Tc 배아를 수용자에게 전달하여 Tc 송아지를 생산하였다.
도 38A 내지 38D는 Tc 태아의 분석을 예시한다. 재생된 Tc 섬유아세포주 및 대조군 비-트랜스제닉 섬유아세포의 G418 선별 (도 38A). Tc 태아 및 대조군에서 IgH 및 Igl 로커스의 게놈 PCR. 3 개의 태아, #5968 (레인 1), #6032 (레인 2) 및 #6045 (레인 3)는 ΔHAC 섬유아세포로부터 유도되었고, 태아 #5580 (레인 4)은 ΔΔHAC 섬유아세포로부터 유도되었다. 대조군으로서, 비-트랜스제닉 태아 (레인 N)를 회수 및 평가하였다 (도 38B). 모든 Tc 태아 및 양성 대조군 인간 간 DNA 샘플 (레인 P)에서는 인간 IgH 및 Igl 로커스가 둘 다 PCR에 의해 검출되었으나 음성 대조군에서는 검출되지 않았다 (레인 N). 음성 대조군 비-트랜스제닉 소과 동물 비장 (레인 N), 클로닝된 Tc 태아의 뇌 (레인 1), 간 (레인 2) 및 비장 (레인 3) 및 양성 대조군 인간 비장 (레인 P)으로부터 RT-PCR로 증폭된, 재배열 및 발현된 인간 Igμ 및 Igλ 전사체 (도 38C). 제91일에 회수한 클로닝된 Tc 태아로부터 RT-PCR로 증폭된 인간 Igμ 및 Igλ 전사체의 대표적인 뉴클레오티드 및 추정되는 아미노산 서열 (도 38D). RT-PCR을 기재된 바와 같이 실시하였다 [Kuroiwa et al., Nature Biotech 18:1086-1090, 2000]. 인간 Igμ 전사체의 경우에는 VH1/5BACK, VH3BACK 및 VH4BACK를 5' 프라이머로 사용하고 Cμ-2를 3' 프라이머로 사용하였다. 인간 Igλ 전사체의 경우에는 Vλ1LEA1, Vλ2MIX 및 Vλ3MIX를 5' 프라이머로 사용하고 CλMIX를 3' 프라이머로 사용하였다. 증폭된 cDNA를 TA 클로닝 키트 (인비트로젠(Invitrogen) 제품)를 사용하여 서브클로닝하고 DNA 자동 서열분석기 (ABI 3700 시스템)로 서열분석하였다.
도 39A 내지 39C는 클로닝된 Tc 송아지의 분석을 예시하는 사진이다. 4 마리의 클로닝된 Tc 송아지; 세포주 #6045로부터의 수컷 송아지 (#50) 및 세포주 #5968로부터의 암컷 송아지 (#1064, #1065, #1066) (도 39A). 클로닝된 Tc 송아지 및 대조군의 PBL로부터의 IgH 및 Igλ 로커스의 게놈 PCR; 송아지 #1064 (레인 1), #1065 (레인 2), #1066 (레인 3), #50 (레인 4), #1067 (레인 5) 및 #1068 (레인 6) (도 39B). 모든 Tc 송아지 및 양성 대조군 인간 간 DNA (레인 P)에서는 인간 IgH 및 Igλ 로커스가 둘 다 게놈 PCR에 의해 검출되었으나 음성 대조군인 비-트랜스제닉 송아지 (레인 N)에서는 검출되지 않았다. 단일 신호를 나타내는 세포 및 이중 신호를 나타내는 세포에서 중기 염색체 확산에서의 FISH 분석 (도 39C). 화살표는 주변 소과 동물 염색체 중의 HAC의 위치를 가리킨다. HAC의 채색은 프로브로서 디곡시게닌 표지된 인간 COT-1 DNA를 사용하여 수행하였고 항-디곡시게닌-로다민으로 검출하였다.
도 40A 및 40B는 소과 동물 태아 섬유아세포에서 라민 B, 라민 A/C, NuMA 및 AKAP95 (도 40A) 및 시험관내 배양된 전핵 및 8 내지 16 세포 단계의 소과 동물 배아 (도 40B)의 면역형광 분포를 예시한다. 화살표는 암컷 전핵 (2 개 전핵 중 가장 작은 것)에서의 NuMA 및 AKAP95 표지를 가리킨다. 삽입도는 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 표지한 DNA이다.
도 40C는 소과 동물 섬유아세포 (Fib) 및 전핵 배아 (PN)에서 라민 B, 라민 A/C, NuMA 및 AKAP95의 이뮤노블롯팅 분석을 예시한다 (막대, 10 ㎛ (도 40A), 50 ㎛ (도 40B)).
도 41A 내지 41D는 소과 동물 NT 배아에서 핵 외피, NuMA 및 AKAP95의 동태를 예시한다. PCC 및 PN 단계에서 표시한 항체 (TRITC)를 사용하여 공여자 섬유아세포 핵의 해리 및 새로운 전핵의 조립을 면역형광으로 모니터링하였다 (도 41A). 유사한 활성화 절차 후의 단성생식 전핵을 검사하였다 (Part. PN). 각 항체로 표지된 배아의 비율(％) (±SD)을 나타내었다 (3 회의 반복 실험에서 그룹 당 n = 약 20 개 배아). 5 μM 이오노마이신을 4분 동안 사용한 후에 10 ㎍/ml CHX/2.5 ㎍/ml 사이토칼라신 D를 4 시간 동안 사용하거나 (b), (b)에서와 같이 이오노마이신/CHX/사이토칼라신 D를 사용한 후에 10 ㎍/ml CHX를 9 시간 사용하거나 (b') 또는 (b)에서와 같이 수행하면서 활성화 처리 동안에 5 ㎍/ml ActD를 사용하여 (b") 수용자 난모세포를 활성화시켰다 (도 41B). DNA (B의 삽입도)는 획스트 33342로 표지하였다 (막대, 10 ㎛). 도 41C는 CHX- 및 ActD-처리한 NT 배아에서 라민 A/C 및 B 및 NuMA의 평균±SD 면역형광 강도를 미처리 (-) NT 배아에 대해 나타낸 막대 그래프이다 (100％ 형광; 3 회의 반복 실험에서 그룹 당 n = 약 30 개 배아). 도 41D는 NT 배아의 전핵에서 AKAP9의 핵내 결합에 대한 막대 그래프이다. PN 단계 단성생식체 (Part.) 및 NT 배아 (NT) 및 공여자 섬유아세포 (Fib)를 0.1％ 트리톤 X-100/1 mg/ml DNAse I/30 0 mM NaCl로 추출한 후에 고정시켰다. 라민 B 및 AKAP95를 면역형광법으로 검사하고, DNA를 획스트 33342로 염색하였다. 데이타는 라민 B, DNA 및 AKAP95의 평균±SD 형광 표지 강도를 비추출 단성생식 배아 또는 NT 배아에서의 형광 또는 체세포에서의 형광에 대해 나타내었다 (100％ 형광; 3 회의 반복 실험에서 그룹 당 n = 약 30 개 배아) (막대, 10 ㎛).
도 42A 내지 42D는 CT가 라민 A/C 및 NuMA가 없는 배아를 생성한다는 것을 입증한다. 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95의 재분포를 유사분열 소과 동물 섬유아세포로부터의 추출물 중에서 인큐베이션한 소과 동물 섬유아세포 핵에서의 면역형광으로 모니터링하였다 [Chaudhary etal., J. Cell Biol. 122:295-306, 1993] (도 42A). DNA를 0.1 ㎍/ml 요오드화프로피듐으로 표지하였다. 표시한 마커의 해리 (표지가 사라짐)를 나타내는 핵의 비율(％)을 도시하였다 (3 회의 반복 실험에서 마커 1 개 당 n > 200 개 핵). PN 배아는 CT, NT, NI 또는 단성생식으로 생성하였고, 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95의 분포는 활성화 개시 후 14 시간이 지난 후에 면역형광으로 검사하였다 ([Poccia et al., Trends Biochem. Sci. 17:223-227, 1992] 및 [Chaudhary et al., J. Cell Biol. 122:295-306, 1993]) (도 42B). DNA를 획스트 33342로 표지하였다. CT, NI 또는 단성생식 배아에서 표시한 마커의 평균±SD 면역형광 강도를 PN-단계 NT 배아에서의 형광 강도에 대해 나타내었다 (NT, 100％ 형광; 3 회의 반복 실험에서 마커 1 개 당 n = 15 내지 20 개 배아) (도 42C). 트리톤 X-100/DNAse I/NaCl을 사용한 추출 후에 PN-단계 NT 및 CT 배아에서의 라민 B, DNA 및 AKAP95의 면역표지 강도를 나타내었다 (도 42D). 값은, 비추출 전핵 NT 및 CT 배아 각각에 대한 평균±SD 형광 강도로 표현하였다 (3 회의 반복 실험에서 1 회 처치 당 마커 1 개 당 n = 약 15 개 배아) (막대, 10 ㎛ (도 42A), 20 ㎛ (도 42B)).
도 43A 및 43B은 시험관내 공여자 핵 해리 및 CT에 의한 재구성된 전핵에서의 TBP 위치 변경을 예시한다. NT 및 CT 동안의 TBP 동태는 공여자 섬유아세포 (Fib), PCC 단계에서의 응축된 염색질 (NT PCC), 유사분열 추출물에서 응축된 공여자 염색체 (MS15 CC), NT 전핵 (NT PN) 및 CT 전핵 (CT PN)의 면역형광 분석으로 파악하여 도 43B에서 비교하였다. DNA는 획스트 33342로 표지하였다 (막대, 20 ㎛). 도 43A에 나타낸 단계에서와 단성생식 전핵 (Part. PN)에서 TBP/AKAP95 및 TBP/DNA 형광 강도 비율을 타나내었다 (도 43B). 그룹 당 10 내지 13 개 배아에서의 평균±SD 형광 강도를 나타내었다.
도 44A는 네오마이신-내성 유전자를 함유하는 본 발명의 프리온 단백질 녹아웃 벡터의 개략도 (pBPrP(H)KOneo 벡터)이다. 상기 도면은 정확하게 표적화된 클론을 확인하는 방법을 예시한다.
도 44B는 퓨로마이신-내성 유전자 (pBPrP(H)KOpuro 벡터)를 함유하는 본 발명의 프리온 단백질 녹아웃 벡터 및 정확하게 표적화된 클론을 확인하는 방법에 대한 개략도이다.
도 44C는 상이한 소과 동물 섬유아세포 세포주에서 본 발명의 프리온 단백질 녹아웃 벡터를 사용할 때 프리온 단백질 로커스에서 일어나는 상동성 재조합의 빈도를 나열한 표이다.
도 45A는 NT 및 SLOT 배아의 전핵에서 라민 B, 라민 A/C, NuMA, AKAP95 및 DNA의 수준을 예시하는 사진이다.
도 45B는 도 45A로부터의 형광 강도 그래프이다.
도 46A 내지 46D는 NT 이후 섬유아세포 핵의 동태를 도시한다. 도 46A는 소과 동물 섬유아세포 및 IVP 전핵 (PN) 및 8 내지 16 세포 단계의 소과 동물 배아에서 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 면역형광 분포를 나타낸다. 삽입도는 획스트 33342로 표지된 DNA이다 (막대, (좌측) 10 ㎛ 및 (우측) 50 ㎛). 도 46B는 태아 섬유아세포 및 전핵 배아에서 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 이뮤노블롯팅 사진이다. 도 46C는 NT 배아의 PCC 및 전핵 (NT-PN) 단계에서 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 면역형광 분석 사진이다 (막대, 10 ㎛). 도 46D는 IVP 배아의 수컷 (MPN) 및 암컷 (FPN) 전핵에서와 NT 배아의 전핵 (NT-PN)에서 표시한 단백질의 면역표지 강도에 대한 막대 그래프이다. 데이타는 항체 형광/획스트 33342 (DNA) 형광의 평균±SD 비율로서 표현하였다. 3 내지 5 회의 반복 실험에서 마커 1 개 당 20 개 초과의 배아를 분석하였다 (A, C, D).
도 47A 내지 47C는 NT 배아 전핵의 특징규명을 예시한다. 도 47A는 1％ 트리톤 X-100/1 mg/ml DNAse I/300 mM NaCl로 원위치 추출한 후의 전핵 IVP 및 NT 배아 및 섬유아세포에서 TBP 및 DNA (획스트 33342)의 면역표지 강도 (평균±SD)에 대한 막대 그래프이다. 표지 강도는 비추출 배아의 표지 강도에 대해 표현하였다 (그룹 당 n = 30 개 배아 또는 세포). 도 47B는 (b) 본원에서 기재한 바와 같이 활성화시키거나, (b') 10 ㎍/ml CHX의 존재하에서 활성화시키거나, 또는 (b") 5 ㎍/ml ActD의 존재하에서 활성화시킨 NT 배아에서의 마커 발현을 예시하는 사진이다 (2 또는 3 회 반복 실험에서 그룹 당 n = 30 개 배아). 삽입도는 DNA를 나타낸다 (막대, 10 ㎛). 도 47C는 도 47B에서와 같이 활성화시킨 배아에서 표시한 단백질 형광/획스트 33342 (DNA) 형광의 면역표지 강도 비율 (평균±SD)에 대한 막대 그래프이다 (마커 1 개 당 1 회 처치 당 n = 15 내지 20 개 배아).
도 48은 SLOT 절차를 예시한다. 단계 1에서는 500 ng/ml SLO를 사용하여 공여자 섬유아세포를 30분 동안 가역적으로 투과가능화한다. 단계 2에서는 투과가능해진 세포를 세척하고 ATP-재생성 시스템을 함유하는 유사분열 추출물 중에서 인큐베이션하여, 염색체 응축을 유발하고 핵 성분의 제거를 촉진시킨다 (화살표). 단계 3에서는 추출물을 제거하고, 임의로는 세포를 2 mM CaCl 2 를 함유하는 배양액 중에서 배양한다. 단계 4에서는 세포를 핵제거된 수용자 난모세포와 융합시키고, 단계 5에서는 난모세포를 NT로 활성화시켜 전핵 형성 및 발생을 유발한다.
도 49A 내지 49C는 유사분열 추출물에서 체세포 핵 파괴의 유도를 나타낸다. 도 49A는 유사분열 추출물이 아폽토시스(apoptosis)를 유발하지 않는다는 것을 입증한다. 무손상 소과 동물 섬유아세포 (레인 1), 5 ㎍/ml 노코다졸을 20 시간 동안 사용하여 아폽토시스가 유도된 섬유아세포 (레인 2) 또는 유사분열에 노출된 SLO-투과가능해진 섬유아세포 (레인 3) 또는 간기 (레인 4) 추출물을 1 시간 동안 항-PARP 항체로 이뮤노블롯팅하였다 (상부 패널). 0.8％ 아가로스에서의 겔 전기영동 및 에티듐 브로마이드을 사용한 염색을 통해 DNA 분해를 평가하였다 (하부 패널). 도 49B는 유사분열 추출물 중 투과가능해진 섬유아세포를 ATP-재생성 시스템과 함께 (+ATP) 또는 상기 시스템 없이 (-ATP) 45 분 동안 인큐베이션한 후에 라민 B, 라민 A/C, TBP 및 AKAP95의 면역형광을 분석한 사진이다 (막대, 10 ㎛). 4 회의 반복 실험으로 분석한 1,000 개 초과의 세포는, 나타낸 바와 같이 일관된 표지를 나타내었다. 도 49C는 간기 섬유아세포 (레인 1), 유사분열시에 1 ㎍/ml 노코다졸과 동기화(synchronization)된 섬유아세포 (레인 2), ATP-재생성 시스템과 함께 또는 상기 시스템 없이 유사분열 추출물에 노출 (레인 3 및 4)시키거나 간기 추출물에 노출시킨 (레인 5) 투과가능해진 섬유아세포로부터 단리된 염색질 및 유사분열 추출물에 노출시킨 온전한 투과가능해진 섬유아세포 (레인 6)의 이뮤노블롯팅 분석 사진이다. 블롯들을 표시한 단백질에 대한 항체로 프로빙(probing)하였다. 히스톤 H4를 겔에서의 단백질 로딩 대조군으로서 사용하였다.
도 50A 내지 50D는 SLOT 배아 핵의 특징규명을 입증한다. 도 50A는 표시한 대로 SLOT 또는 NT에 의해 난모세포로 도입된 지 30분 이내의 염색질 형태 (화살표)를 예시한다. 점선은 난모세포 세포질체를 나타낸다. 우측 패널은 SLOT 및 NT 배아에서 공여자 염색질이 팽창되었음을 나타낸다 (막대, 20 ㎛). 도 50B는 NT 또는 SLOT로 생성된 전핵 (상부의 2 개 패널) 및 8 내지 16 세포 단계 (하부의 2 개 패널) 배아에서 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 분포를 예시한다 (막대, 20 ㎛) (3 회의 반복 실험에서 마커 1 개 당 n = 20 내지 30 개 배아). 도 50C는 NT 또는 SLOT 배아의 전핵에서 표시한 단백질의 형광 강도를 획스트 33342 (DNA)의 형광 강도에 대한 면역표지 강도의 비율 (평균±SD)로서 나타낸 막대 그래프이다 (3 회의 반복 실험에서 마커 1 개 당 n = 약 20 개 배아). 도 50D는 0.1％ 트리톤 X-100/1 mg/ml DNAse I/300 mM NaCl을 사용하여 추출한 후의 전핵 NT 및 SLOT 배아에서 TBP 및 DNA (획스트 33342)의 면역표지 강도 (평균±SD)를 비추출 배아 (2 회의 반복 실험에서 그룹 당 n = 15 개 배아)에 대해 나타낸 막대 그래프이다.
도 51A 내지 51E는 SLOT 및 NT 클론의 발생 및 형태 평가를 예시한다. 도51A는 NT 및 SLOT 클론의 생체내 발생 비율을 나타내는 막대 그래프이다. 임신율은 임신 기간 중 표시한 날에 초음파촬영술로 평가하였다. 송아지의 출생율(％) 및 출산후 24 시간 후에도 살아있는 송아지의 비율(％)도 나타냈다. 12 마리의 SLOT 소아지 및 23 마리의 NT 송아지는 각각 8 주에 걸친 59 개 및 211 개의 배아 전달로 태어났다. P 값은 피셔 정밀 검정으로 산출하였다. 도 51B는 5 내지 6주령의 SLOT 클론 (시민탈(Simintal)×안구스(Angus) 교배된 동일 암컷)을 나타내는 사진이다. 도 51C는 출생 24 시간 이내에 개개의 SLOT 및 NT 송아지 및 태반의 스코어를 나타내는 그래프이다. 도 51D는 개개의 SLOT 및 NT 클론의 출생시 체중을 나타내는 그래프이다. 도 51C 및 51D에서 SLOT (원형) 또는 NT (사각형) 클론의 한가지 색상은 동일 개체의 송아지 스코어, 태반 스코어 및 출생시 체중을 나타낸다. 도 51E는 SLOT 및 NT 클론의 송아지 스코어, 태반 스코어 및 출생시 체중에 대한 박스 플롯 분석이다.
본 발명은 부분적으로는 본원에 기재한 방법을 이용하여 소과 동물 프리온 로커스를 놀랄만큼 높은 빈도로 불활성화시킨다는 것을 기초로 한다. 정확하게 표적화된 수많은 프리온 녹아웃 세포는 프리온 녹아웃 유제동물 (예를 들어, 소과 동물)의 생성을 크게 용이하게 한다. 추가로, 본 발명은 핵 전달 효율을 증가시켜 프리온 녹아웃 유제동물의 제조를 더욱 단순화시키는 개선된 방법을 제공한다. 생성된 이들 트랜스제닉 유제동물은 농업 제품 (예를 들어, 육류) 및 제약 제품 (예를 들어, 트랜스제닉 유제동물에서 1 종 이상의 이종 핵산에 의해 코딩되는 인간 치료 항체)의 바람직한 공급원이다.
공여자 소과 동물 세포의 프리온 로커스를 불활성화시키는데 사용되는 녹아웃 벡터는, 부분적으로는 진뱅크에 기탁된 소과 동물 프리온 단백질 유전자 로커스 (AJ298878)의 서열을 기초로 한다. 녹아웃 벡터 제조에 이용되는 프리온 단백질 유전자 게놈 서열의 공급원은 유전적으로 변형된 섬유아세포 세포주의 서열과 매치된다. 특히, 프리온 단백질 유전자의 홀스타인 게놈 서열은 홀스타인-유래의 섬유아세포에서의 효율적인 표적화를 위한 녹아웃 벡터의 제조에 이용되었다. 녹아웃 벡터는 프리온 로커스 내에서 인접하여 위치한 프리온 로커스에 상동성이 있는 2 개 영역을 함유하며, 2 개의 loxP 부위가 플랭킹(flanking)되어 있는 약물-내성 유전자 및 전사 종결 (STOP) 서열을 프리온 로커스에 삽입하도록 고안되었다. 별법의 전략은 녹아웃 벡터 내의 인접하지 않은 2 개의 상동성 영역을 사용하여 2 개의 상동성 영역 사이에 있는 내인성 프리온 단백질 유전자 영역을 결실시키는 것을 포함한다. 프리온 단백질의 활성을 감소시키기 위해서, STOP 서열을 엑손 3에서 그의 개시 ATG 코돈 바로 뒤에 삽입시켰다. 상기 로커스에서의 효율적인 상동성 재조합을 위해서, 하나의 상동성 영역은 다른 상동성 영역보다 더 길었다. 특히, 3' 영역의 길이는 8.3 kb이었으며, 이것은 1.1 kb 5'상동성 영역의 길이에 비해 훨씬 더 긴 것이다. 상동성 재조합이 집중적으로 일어나도록 하기 위해서, 음성 선별 마커, 예컨대 DT-A 유전자를 프리온 단백질 유전자와는 반대 방향으로 하여 상기한 짧은 5' 상동성 영역에 부착시켰다. 녹아웃 벡터를 적절한 제한 효소로 선형화한 후에 형질감염시켜서, 기본 플라스미드 벡터, 예컨대 pBluescript의 pUC를 음성 선별 마커의 말단에 부착시킬 수 있었다. 추가로, 상동성 재조합을 증대시키기 위해서, 선형화된 녹아웃 벡터에 1 mM 스페르미딘을 함유하는 HBS (Hepes 완충 염수)를 처리한 후에 섬유아세포에 첨가하였다.
폴리아민 및 임의의 다른 화합물을 표적화 벡터에 첨가하여 상동성 재조합의 효율을 높일 수 있다. 폴리아민의 바람직한 농도는 0.1 내지 10 mM이고, 가장 바람직한 농도는 1 mM이다. 폴리아민은 예를 들어 스페르미딘, 스페르민, 카다베린 및 퓨트레신 등으로부터 선택할 수 있다. 바람직한 폴리아민은 스페르미딘이다. 다른 화합물은 DNA의 포스페이트 잔기와 이온 결합을 형성할 수 있는 화합물, 예컨대 폴리-L-리신 또는 폴리-L-아르기닌으로부터 선택할 수 있다.
추가로, 상동성 재조합 효율은 음성 선별 마커를 선형화된 표적화 벡터의 말단에 노출되지 않도록 배치하여 높일 수 있다. 음성 선별 마커의 기능적 단위의 5' 및 3' 말단을 선형화된 표적화 벡터의 5' 및 3' 말단 각각으로부터 1 kb 이상, 바람직하게는 2 kb 이상 떨어뜨려 배치하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 상동성 게놈 서열은 음성 선별 마커의 5' 및 3' 측에 배치하여, 음성 선별 마커와 선형화된 표적화 벡터 말단 사이에 충분한 거리가 생기도록 한다. 선형화된 표적화 벡터에서, 음성 선별 마커의 다른 측에는 1 kb 이상, 바람직하게는 2 kb 이상의 여분(extra) 서열을 보유하도록 고안할 수 있다. 예를 들어, 표적화 벡터 내의 pUC 벡터 서열을 이러한 여분 서열로서 사용할 수 있다.
특별한 한가지 방법에서, 홀스타인 태아 섬유아세포를 전기천공하여 홀스타인-유래의 녹아웃 벡터를 넣고, 반접합성 표적화 클론을 50％ 초과라는 놀랄만큼 높은 빈도로 수득한다. 정확하게 표적화된 수많은 클론은 건강한 태아 및 송아지를 효율적으로 생성할 만큼 충분해야 한다. 동종접합성 표적화된 태아 및 송아지를 생성하기 위해서, 반접합성 표적화된 태아로부터 단리된 반접합성 녹아웃 섬유아세포를 전기천공하여 동일한 녹아웃 벡터 또는 상이한 항생제 내성 유전자를 갖는 녹아웃 벡터를 넣어, 프리온 로커스의 나머지 대립유전자를 돌연변이시킬 수 있다. 별법으로, 수컷 및 암컷 반접합성 녹아웃 소를 교배하여 동종접합성 녹아웃 송아지를 생성할 수 있다.
이종 항체를 발현하는 유제동물의 생성 방법
예를 들어 W0 02/70648 및 문헌 [Kuroiwa et al. Nature Biotechnol. 20;889-894, 2002]에 기재되어 있는 바와 같이, 인간 항체를 생산하는 동종접합성 프리온 단백질 녹아웃 소과 동물 (프리온 단백질 KO/hAb 소과 동물)은 인간 이뮤노글로불린 로커스를 동종접합성 프리온 단백질 녹아웃 유전자형을 갖는 소과 동물 섬유아세포에 도입하여 생성할 수 있다. 적합한 접근법의 예로는 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 둘 다 함유하는 인간 인공 염색체 (HAC)를 유제동물로 삽입하는 방법 또는 인간 B-세포 또는 B-세포 전구체를 태아 단계 동안의 유제동물 또는 태어난 후의 유제동물 (예를 들어, 면역 결핍되거나 면역 저해된 유제동물)에 삽입하는 방법 등이 있다 (예를 들어, PCT 공개 WO 01/35735 및 W0 02/074938 참조).
표준 방법을 이용하여 특정 종 (예를 들어, 인간)의 항체를 생산하는 유전자 (바람직하게는 전체 유전자 로커스)를 함유하는 목적 핵산을 공여자 세포에 도입하여, 이종 항체를 발현하는 트랜스제닉 유제동물 생성에 이용할 수 있다. 인간 인공 염색체, 예컨대 PCT 공개 WO 97/07671 및 WO 00/10383에 개시되어 있는 바와 같은 인간 인공 염색체를 사용하는 것이 바람직하다. 이들 인간 인공 염색체는 또한 일본 특허 JP 30300092에도 기재되어 있다. 이들 공개 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 또한, 인간 이뮤노글로불린 유전자를 함유하고 이를 발현하는 인공 인간 염색체 또는 트랜스진의 제조법은 문헌 ([Shen et al., Hum. Mol. Genet. 6:1375-1382 (1997)], [Kuroiwa et al., Nature Biotechnol. 18:1086-1090 (2000)], [Loupert et al., Chromosome 107:255-259 (1998)], PCT 공개 WO 00/10383, WO 98/24893, WO 96/33735, WO 97/13852, WO 98/24884 및 WO 97/07671 및 미국 특허 제5,877,397호, 동 제5,874,299호, 동 제5,814,318호, 동 제5,789,650호, 동 제5,770,429호, 동 제5,661,016호, 동 제5,633,425호, 동 제5,625,126호, 동 제5,569,825호 및 동 제5,545,806호)에도 개시되어 있고, 이들 문헌 각각은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 인간 인공 염색체는 또한 이종 항체 유전자를 야생형 동물 세포에 도입시키는데 이용될 수도 있으며, 이것은 상기 기재된 방법을 사용하여 달성된다. 동물 세포, 특히 태아 섬유아세포에 인공 염색체를 도입하는 것은 본원에 기재된 바와 같은 미소세포 융합법에 의해 실시할 수 있다.
인간 인공 염색체의 사용에 대한 별법으로, 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하는 핵산을 YAC 벡터, BAC 벡터 또는 코스미드 벡터를 사용하여 염색체에 통합시킬 수 있다. 이종 Ig 유전자를 포함하는 벡터 (예를 들어, PCT 공개 WO 98/24893, WO 96/33735, WO 97/13852 및 WO 98/24884 및 미국 특허 제5,849,992호 및 동 제5,827,690호에 기재된 바와 같음)를 공지된 방법, 예컨대 전기천공, 리포형질감염, YAC 벡터를 포함하는 효모 세포벽불완전제거균(spheroplast)과의 융합 등에 의해 태아 섬유아세포에 도입할 수 있다. 또한, 이종 Ig 유전자를 포함하는 벡터를 태아 섬유아세포의 내인성 Ig 유전자 로커스에 표적화시켜, 이종 Ig 유전자의 도입과 동시에 내인성 Ig 유전자를 파괴할 수 있다.
또한, 이종 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하는 핵산의 통합은 상기 론버그(Lonberg) 등의 특허에 기재된 바와 같이 실시할 수도 있다. 이종 이뮤노글로불린 유전자를 숙주 유제동물의 염색체에 삽입하는데 사용되는 "녹인(knockin)" 구조물에서, 1 개 이상의 이뮤노글로불린 유전자 및 항생제 내성 유전자는 상기 구조물로 형질감염된 세포형에서 활성이 있는 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 구조적으로 활성이거나 유도가능하거나 또는 조직 특이적인 프로모터를 사용하여, 형질감염된 세포가 그들에서 생성된 항생제 내성에 기초하여 선별되도록 하면서 통합된 항생제 내성 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 별법으로, Ig 유전자(들) 및 항생제 내성 유전자를 함유하는 녹인 카세트가 프로모터에 작동가능하게 연결되지 않은 녹인 구조물을 사용할 수 있다. 이러한 경우, 녹인 카세트가 내인성 프로모터의 하류를 통합하는 세포는 내인성 프로모터의 제어하에서 생성된 항생제 내성 마커의 발현을 기초로 하여 선별될 수 있다. 이렇게 선별된 세포를 본원에 기재된 핵 전달 절차에 사용하여 숙주 염색체에 통합된 이종 이뮤노글로불린 유전자를 함유하는 트랜스제닉 유제동물을 생성할 수 있다.
유사한 방법론을 사용하여, 다른 종 중에서 상이한 종, 예컨대 개, 고양이, 다른 유제동물, 비-인간 영장류의 Ig를 발현하는 유전자를 함유하는 인공 염색체를 생산 및 삽입할 수 있다. 상기에서 고찰하고 당업계에 공지된 바와 같이, 상이한 종의 이뮤노글로불린 유전자는 상이한 종에서도 실질적인 서열 상동성을 나타내는 것으로 널리 공지되어 있다.
일단 삽입된 인공 염색체, 예를 들어 인간 인공 염색체가 세포주, 예를 들어 소과 동물 태아 섬유아세포에 안정하게 도입된 것으로 결정되면, 이것을 핵 전달의 공여자로 이용할 수 있다. 이것은 PCR법에 의해 결정될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 송아지는 안정하게 도입된 핵산, 예컨대 인간 인공 염색체를 포함한다. 안정하게 혼입된 핵산 (예를 들어, 인간 인공 염색체)를 포함하는 송아지가 수득된 후에는, 상기 동물을 시험하여 이들이 면역화 및 친화도 성숙에 반응하여 인간 Ig 유전자를 발현하는지 여부를 결정한다.
이종 항체를 또한 발현하는 유제동물에서 내인성 항체의 생성을 감소시키는 방법
또한, 상기 기재된 전체 절차의 변형을 실시할 수도 있다. 예를 들어, 생성된 트랜스제닉 유제동물에 의해 발현된 내인성 항체의 양을 감소시키기 위해, 이종 핵산을 삽입하기 전 또는 후에 공여자 세포내에서 하나 이상의 내인성 Ig 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 또한, 이종 Ig 유전자를 보유하는 동물을 내인성 Ig 유전자가 불활성화된 동물과 교배시킬 수 있다. 공여자 세포 (예를 들어, 소과 동물 섬유아세포)를 순차적으로 조작하는 예시적인 방법을 하기에 기재한다.
우선, 동종접합성 프리온 단백질 녹아웃 태아 섬유아세포를 생성한다. 이어서, 반접합성 소과 동물 이뮤노글로불린 중쇄 (BIgH) 녹아웃 섬유아세포를 유전자 표적화로 생성하고, 핵 전달법 (예를 들어, SLOT 또는 염색질 전달법)을 이용하여 태아를 생성한다. 동종접합성 BIgH 녹아웃 섬유아세포를 제2 유전자 표적화로 생성한 후에 핵 전달법을 이용하여 태아를 생성한다. 반접합성 소과 동물 이뮤노글로불린 경쇄 (BIgL) 녹아웃 섬유아세포를 유전자 표적화로 생성한 후에 핵 전달법을 이용하여 태아를 생성한다. 동종접합성 BIgL 녹아웃 섬유아세포를 제2 유전자 표적화로 생성하고 핵 전달법을 이용하여 태아를 생성한다. 이어서, 인간 이뮤노글로불린 유전자 로커스를 동종접합성 프리온단백질/BIgH/BIgL 녹아웃 유전자형을 갖는 상기한 순차적 녹아웃 섬유아세포에 도입하고, 핵 전달법을 이용하여 태아 및 송아지를 생성한다.
본 발명의 유제동물을 생성하는 예시적인 방법
내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 유제동물을 생성하는 바람직한 방법에는, 공여자 유전 물질을 수용자 난모세포로의 삽입 이전에 리모델링하여 트랜스제닉 유제동물을 형성하는 것이 포함된다. 리모델링이란, 생성된 핵 이식 난모세포의 발생을 온전한 세포 또는 무손상 핵을 수용자 난모세포에 전달하여 유도된 것보다 더 개선시키는 임의의 형태 변화를 지칭한다. 리프로그래밍은 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 공여자 핵을 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액)에서 인큐베이션하여 핵 외피를 용해시키고 가능하게는 염색질을 응축시킴으로써 달성한다. 이러한 핵 외피 파괴 및 염색질 응축은 염색체에 부착되어 있으며 난모세포, 배아 또는 태아의 발생에 바람직하지 못한 유전자의 전사를 다른 방식으로 촉진시키는 전사 조절 단백질의 유리를 허용한다. 추가의 조절 단백질은 염색질 덩어리를 수용자 난모세포로의 전달 이전에 정제하여 제거할 수 있다. 별법으로, 염색체로부터 유리된 특이적 조절 단백질은 이들이 염색체와 재결합하는 것을 방지하기 위해 면역고갈되거나 또는 리프로그래밍된 배지 (예를 들어, 세포 추출물)로부터 다른 방식으로 제거될 수 있다. 핵 전달 후에, 난모세포 세포질로부터의 새로운 단백질은 난모세포에서의 염색질 탈응축 및 핵 외피 형성 동안에 염색체에 결합될 수 있다. 이러한 단백질은 난모세포를 생존가능한 자손으로 발육시키는 유전자의 전사를 촉진시킨다.
트랜스제닉 유제동물의 생산에 이용할 수 있는 다른 클로닝 방법에는 투과가능해진 세포 (즉, 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 세포)를 리프로그래밍 배지 (예를 들어, 세포 추출물)에서 인큐베이션하여 세포에 인자들을 부가하거나 제거함으로써 상기 세포를 리프로그래밍하는 것이 포함된다. 투과가능해진 세포의 원형질막은 바람직하게는 재밀봉하여 목적 인자들을 봉입시키고 세포의 막 일체성을 복구한다. 이어서, 리프로그래밍된 세포를 수용자 난모세포에 전달하여 클로닝된 포유동물을 생산한다. 이러한 클로닝 방법은 이종 이뮤노글로불린 핵산이 없는, 제60일 이후에도 생존한 태아를 생산하는데 사용되어 왔다. 예비 결과에 의하면, 제40일 내지 제60일의 태아 생존율은 통상적인 핵 전달 태아의 경우 (8/16; 50％)보다 상기 방법을 사용하여 형성된 태아에서 (7/10; 70％) 더 높다. 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 갖고(갖거나) 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 태아에 대해서도 유사한 결과가 기대된다.
별법의 방법에서, 태반 조직의 대부분이 한 유전자 공급원에서 얻어지고 태아 조직의 대부분은 다른 유전자 공급원에서 얻어진 키메라 배아를 생성한다. 이러한 키메라 배아는 태반의 이상이 더 적을 수 있기 때문에 생존율이 증가될 수 있다. 이러한 한 방법에서는, 시험관내 수정되거나 또는 자연 발생 배아로부터의 세포를, 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 가지며 임의로는 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산 갖고 통상적인 핵 전달 방법에 의해 생산되거나 또는 본원에 기재된 다른 임의의 클로닝 방법에 의해 생산된 배아로부터의 세포와 접촉시킨다. 예를 들어, 시험관내 수정된 배아로부터의 세포를 핵 전달 배아의 주변부 (예를 들어, 투명대와 배아 자체의 사이)에 주입할 수 있다. 상기 방법은 제40일에 25％의 생존율을 갖는 대조군 핵 전달 배아에 비해 67％의 생존율을 갖는, 이종 항체 유전자를 갖지 않는 키메라 배아를 생산하는데 사용되었다. 내인성 프리온 핵산에 돌연변이를 갖고(갖거나) 이종 항체를 코딩하는 1 종 이상의 핵산을 갖는 핵 전달 배아로부터의 세포를 사용해도 유사한 결과가 기대된다. 별법의 방법에서는, 밀집전, 시험관내 수정되거나 자연 발생 배아로부터의 세포를 밀집전 핵 전달 배아로부터의 세포와 함께 각각의 배아로부터의 세포가 재조직화되어 단일 키메라 배아를 생성하는 것을 허용하는 조건하에서 인큐베이션한다 [Wells and Powell, Cloning 2:9-22, 2000]. 두 방법 모두의 경우에서, 시험관내 수정되거나 자연 발생 배아로부터의 세포는 우선적으로 태반에 혼입되고, 핵 전달 방법으로부터의 세포는 우선적으로 태아 조직에 혼입된다.
본 발명의 선행 기술에 관한 언급
인간 Ig는 마우스에서 발현되어 왔지만, 항체 유전자 구조, 항체 생산 메카니즘 및 B-세포 기능의 차이 때문에, 인간 Ig가 소과 동물 또는 다른 유제동물에서 단편적으로 재배열 및 발현될 것인지 여부를 예측할 수는 없었다. 특히, 마우스와는 달리, 소 및 양은 면역생리학적으로 인간과 상이하다 ([Lucier et al., J. Immunol. 161:5438, 1998], [Parng et al., J. Immunol. 157:5478, 1996] 및 [Butler, Rev. Sci. Tech. 17:43, 2000]). 예를 들어, 소과 동물 및 양과 동물에서의 항체 유전자의 다양화는 인간 및 마우스에서와 같은 유전자 재배열보다 유전자 전환에 훨씬 더 의존한다. 또한, 인간 및 마우스에서 B-세포는 1차적으로 골수에 국소화되는 반면, 소과 동물 및 양과 동물의 B-세포는 회장의 파이어판(Peyer's patch)에 국소화된다. 그 결과, 본 발명 이전에는, 불가능하지는 않더라도 소과 동물 (또는 다른 유제동물)의 B-세포 계통내에서 인간 이뮤노글로불린 로커스의 이뮤노글로불린 재배열 및 다양화가 일어날 것인지 여부를 예측하기가 어려웠다. 또한, 소과 동물이 생존할 수 있는지, 즉, 그의 내인성 Ig의 부재하에서 또는 인간 항체의 간섭하에서 정상적인 면역 기능을 유발할 수 있는지의 여부 또한 예측불가능하였다. 예를 들어, 인간 Ig를 발현하는 소과 동물 B-세포가 소과 동물에서 회장의 파이어판으로 정확하게 이동할 것인지의 여부가 (인간에서는 일어나지 않기 때문에) 확실치 않았다. 또한, 보체 활성화를 매개하고, 사이토카인의 유리를 유도하고, 항원을 제거하는 인간 Fc 수용체가 소과 동물계에서 정상적으로 기능할 것인지 여부가 분명하지 않았다. 인간 Ig가 기능적으로 발현되거나 적절한 면역 반응을 제공할 만큼 충분한 양으로 발현될지 여부가 불확실했기 때문에 이러한 유제동물이 생존할지 여부를 예측할 수 없었다. 또한, 인간 염색체가 트랜스제닉 유제동물에서 안정하게 유지될지의 여부도 불확실하였다.
본 발명에서 이용될 접근법을 상기에 기재하는 한편, 이용된 기술은 이하에 더욱 상세하게 설명하였다. 이러한 실시예들은 본 발명을 예시하기 위해 제공되는 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 특히, 이들 실시예는 트랜스제닉 소과 동물에 중점을 두었으나, 기재된 방법들은 임의의 트랜스제닉 유제동물을 생산 및 시험하는데 이용할 수 있다.
실시예 1: 프리온 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 유제동물
PrP 로커스의 2 개 대립유전자가 둘 다 돌연변이된 소과 동물 섬유아세포 클론을 순차적인 상동성 재조합으로 생성하였다. PrP 동종접합성 녹아웃 세포 생성을 위한 DNA 구조물을 사용하여 네오마이신 또는 퓨로마이신-내성 유전자 (실시예 3에 neo 또는 puro로 기재되어 있음) 및 전사 종결 카세트 (STOP) 둘 다를 엑손 3에서 그의 개시 ATG 코돈 바로 뒤에 삽입시켜, 기능성 전장 PrP mRNA의 전사를 방지하였다. 따라서, 생성된 미성숙 PrP 전사체는 기능적 코딩 도메인이 결핍되어 있다. 소과 동물 섬유아세포 세포주를 1차 전기천공하여 neo 유전자를 함유하는 DNA 구조물 (즉, PrPKOneo 벡터)을 넣은 후에 네오마이신-내성 콜로니를 단리하였다. PCR 분석에 기초할 때, 몇몇 콜로니에서는 엑손 3에서 상동성 재조합이 발생하였다. 따라서, PrP 로커스의 하나의 대립유전자가 돌연변이된 소과 동물 섬유아세포 세포주가 생성되었다. 반접합성 돌연변이된 (헤미-PrPKO) 섬유아세포로부터, PrP 로커스의 하나의 대립유전자가 돌연변이된 3 개 태아를 생성하고, 헤미-PrPKO 섬유아세포 세포주를 재확립하였다. 이어서, 헤미-PrPKO 섬유아세포를 2차 전기천공하여 puro 유전자를 함유하는 다른 DNA 구조물 (즉, PrPKOpuro 벡터)을 넣은 후에 퓨로마이신-내성 콜로니를 단리하였다. PCR 분석에 기초할 때, 몇몇 콜로니에서는 나머지 대립유전자의 엑손 3에서 상동성 재조합이 약 5％의 빈도로 발생하였다. 이러한 방법으로, PrP 로커스의 2 개 대립유전자가 둘 다 돌연변이된 소과 동물 섬유아세포 클론 (호모-PrPKO)을 생성하였다.
동종접합성 돌연변이된 (호모-PrPKO) 섬유아세포로부터, PrP 로커스의 2 개 대립유전자가 둘 다 돌연변이된 10 개 태아가 생성되었으며, 호모-PrPKO 섬유아세포가 재확립되었다. 이러한 호모-PrP KO 섬유아세포에서는, PrP 발현이 전혀 없다는 것을 RT-PCR 분석으로 확인하였다. 호모-PrPKO 섬유아세포는 동일한 녹아웃 벡터 및 동종접합성 녹아웃 세포 선별을 위한 고농도의 항생제를 함께 사용하여 생성할 수도 있다. 핵 전달법을 이용하면, 호모-PrPKO 송아지가 호모-PrP 섬유아세포로부터 생성될 것이다.
이러한 방법을 하기에 기재한다.
프리온 단백질 녹아웃 벡터의 제조
프리온 단백질 녹아웃 벡터를 하기와 같이 제조하였다 (도 44A). 프리온 단백질 유전자의 엑손 3 주변의 게놈 DNA를 단리하기 위해, DNA 프로브를 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭시켰다: 5'-CCA CAT AGG CAG TTG GAT CC-3' (서열 69) 및 5'-ATA AGA GGC CTG CTC ATG GC-3' (서열 70). 상기 프로브를 사용하여, 소과 동물 (홀스타인) 게놈 λ 파지 라이브러리를 스크리닝하여 4 개의 양성 λ 파지 클론을 확인하였다. 상기 4 개의 클론 중 1개 클론을 제한 지도작성을 통하여 더욱 분석하였다. 엑손 3 및 1.2 kb BamHI-BglII 단편을 함유하는 8.3 kb BamHI 게놈 단편 (3'상동성 아암)을 pBluescript II SK(-)에 서브클로닝한 후에 neo 및 STOP 카세트를 개시 ATG 코돈 바로 뒤에 위치하는 BamHI 부위에 삽입하였다. BglII 부위를 평활 말단으로 전환시키고, 상기 부위에 NotI-링커를 삽입하였다. 이어서, 디프테리아 독소 유전자 (DT-A, 깁코(Gibco) 제품)를 새로 생겨난 NotI 부위에 부가하였다. 표적화 카세트에 DT-A를 네오마이신-내성 유전자에 대해 역방향으로 삽입하여 표적화 카세트가 게놈 (pBPrP(H)KOneo 벡터)에 랜덤하게 통합된 세포를 사멸시켰다. 또한, puro 유전자를 함유하는 유사한 녹아웃 벡터 pBPrP(H)KOpuro 벡터; 도 44B)를 제조하였다. 이들 프리온 단백질 녹아웃 벡터는 SrfI 제한 효소 (도요보(TOYOBO) 제품)을 사용하여 선형화킬 수 있어서, pBluescript II SK(-)가 DT-A 유전자에 부착되도록 할 수 있다.
형질감염/녹아웃 절차
태아 수컷 홀스타인 섬유아세포 세포주의 형질감염을 하기하는 표준 전기천공 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 소과 동물 태아 섬유아세포 배양에 사용되는 배지는 알파 MEM (깁코 제품, 12561-049) 500 ml, 송아지 태아 혈청 (하이클론(HyClone) ＃ABL13080) 50 ml, 페니실린-스트렙토마이신 (시그마(Sigma) 제품) 5 ml 및 2-머캡토에탄올 (깁코/BRL ＃21985-023) 1 ml를 함유하였다. 형질감염시키기 하루 전에는 현미경 검사에 의해 80 내지 100％ 전면생장된 것으로 측정된 세포를 T175 조직 배양 플라스크에 접종하였다. 형질감염 당일에는 약 10 7 개의 소과 동물 섬유아세포를 트립신 처리하고, 알파-MEM 배지로 1 회 세척하였다. 세포를 알파-MEM 800 ㎕에 재현탁한 후에는 1 mM 스페르미딘을 함유하는 HBS (Hepes 완충 염수)에 미리 용해시켜 둔 pBPrP(H)KOneo 벡터 30 ㎍을 세포 현탁액에 첨가하고 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. 세포-DNA 현탁액을 전기천공 큐벳으로 옮기고, 550 V 및 50 μF에서 전기천공하였다. 이어서, 전기천공된 세포를 혈청을 보충한 알파-MEM 배지가 들어 있는 60 개의 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48 시간 동안 배양한 후에는 배지를 500 ㎍/ml의 G418을 함유하는 배지로 교체하고, 세포를 2 내지 3 주 동안 배양하여 네오마이신 내성 세포를 선별하였다. 선별한 후에, 100％ 전면생장에 가깝게 도달한 모든 콜로니를 골라 내서 반복 실험 플레이트 (24-웰 플레이트)에 나누었다. 이 중 한 플레이트의 세포는 게놈 DNA 추출에 사용하고, 다른 플레이트의 세포는 핵 전달에 사용하였다. 게놈 DNA를 콜로니로부터 추출하고 목적 상동성 재조합 반응에 대해 PCR로 스크리닝하였다. 전형적으로는 약 100 개의 G418-콜로니를 분석하였다.
표적화된 통합에 대한 스크리닝
상기 기재된 바와 같이, 퓨어진(PUREGENE) DNA 단리 키트 (젠트라 시스템스(Gentra Systems))를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 각각의 24-웰로부터 게놈 DNA를 독립적으로 추출하였다. 각각의 게놈 DNA 샘플을 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 20 ㎕ 및 1 mM EDTA (EDTA)에 재현탁하였다. 하기하는 프라이머 쌍으로 PCR을 수행하여 스크리닝하였다: F7 (5'-TGT CAA AGA GAC ACT CCT CAT TTG TCT TCC-3', 서열 71) 및 R7 (5'-TCA TAG CCG AAT AGC CTC TCC ACC C-3', 서열 72). 하나의 프라이머 서열은 녹아웃 벡터에 위치하고, 다른 프라이머의 서열은 표적화된 내인성 로커스에서 통합된 벡터 바로 외부에 위치한다 (도 44A). 따라서, 예상되는 PCR 산물은 녹아웃 벡터가 상동성 재조합에 의해 표적화 로커스에 통합된 경우에만 검출된다. PCR 반응 혼합물은 물 17.9 ㎕, 10× LA PCR 완충액 II (Mg 2+ 첨가) 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 게놈 DNA 2 ㎕ 및 LA Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 하기 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션하는 PCR 반응을 30 회 수행하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초 및 68 ℃에서 5 분. PCR 후에, 반응 혼합물을 전기영동법으로 분석하였다. 스크리닝된 네오마이신-내성 클론 94 개 중 대략 50％에서 예상된 크기의 PCR 산물이 생성되었다 (도 44B). 이들 양성 클론에 대해 또 다른 프라이머 쌍인 F10 (5'-TGA AGA TGT CCC AGT GCT GGG GAT-3', 서열 73) 및 R10 (5'-GAG TTA GGG GCG GGA CTA TGG TTG C-3', 서열 74)을 사용한 PCR 증폭을 수행하여, 예상된 크기의 2.7 kb PCR 산물이 생성되는 것을 확인하였다. 또 다른 섬유아세포 세포주인 암컷 F1 (홀스타인×저지(Jersey)) 세포주에서 50％ 초과의 높은 빈도의 상동성 재조합이 재현되었다 (도 44C). 이처럼, 사용된 초기 세포주와는 무관하게 프리온 로커스의 대립유전자 중 하나가 녹아웃 벡터에 의해 돌연변이된 소과 동물 섬유아세포 세포주가 성공적으로 생성되었다.
염색질 전달
반접합성 프리온 녹아웃 세포 또는 이들 세포로부터의 핵을 본원에 기재한 임의의 핵 전달 방법에 사용하여, 반접합성 프리온 녹아웃 유제동물 (예를 들어, 녹아웃 소과 동물 송아지)을 생성할 수 있다. 원한다면, 녹아웃 태아 또는 살아있는 유제동물로부터의 세포를 하기에 기재하는 바와 같이 사용하여 동종접합성 프리온 녹아웃 세포를 생성할 수 있다. 특정 한 방법에서, 섬유아세포 (예를 들어, 소과 동물의 초대 태아 섬유아세포)를 유사분열시에 1 ㎍/ml 노코다졸과 18 시간 동안 동기화하고, 유사분열 진탕 분리(shake-off)로 수거하여 포스페이트 완충 염수 중에 2 회 세척하고 세포 용해 완충액 (20 mM Hepes, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 10 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제) 중에 1 회 세척하였다. 침강된 세포를 1배 부피의 빙냉 세포 용해 완충액 중에 재현탁하여 빙상에서 1 시간 동안 팽윤되게 하고, 치밀하게 맞는 유리 막자를 사용하여 다운스(Dounce) 균질화하였다. 상기 용해물을 15,000×g로 15 분 동안 4 ℃에서 원심분리하고 상등액 (유사분열 추출물)을 분취하여 액체 질소 중에 동결시켜 -80 ℃에 저장하였다. 신선한 추출물 또는 동결된 추출물을 사용하였다.
시험관내-성숙된 난모세포의 핵을 20 hpm에서 제거하였다. 선택된 콜로니로부터의 형질감염 소과 동물 태아 섬유아세포를 Ca 2+ /Mg 2+ -무함유 HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) 중에 세척하고, 31.2 U 스트렙토리신 O (SLO, 시그마 제품) 중 HBSS 100 ㎕가 첨가된 현탁액에서 상기 세포를 30 분 동안 대략 37 ℃의 수조에서 인큐베이션하여 투과가능화했다. 투과가능화는, 막 불투과성 DNA 염료인 요오드화프로피듐 (0.1 ㎍/ml)의 흡수로 평가하였다. 투과가능해진 섬유아세포를 침강시켜 세척하고 ATP-발생 시스템 (1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 포스페이트 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)을 함유하는 40 ㎕ 유사분열 추출물 중에서 대략 37 ℃에서 30 분 내지 45 분 동안 인큐베이션시켰다. 분취액을 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 표지하여 염색질 응축을 모니터링하였다. 인큐베이션 종료시에, 반응 혼합물을 500 ㎕ 알파-MEM/10％ 소과 동물 태아 혈청 (하이클론 제품)으로 희석시켰다. 세포를 핵제거된 난모세포에 융합시키고, 난모세포를 28 hpm에서 활성화시키고, 태아를 포배 단계까지 시험관내 배양하였다. 수용자 암컷 당 2 개의 배아를 전달했다. 임신 여부를 초음파촬영으로 모니터링하고, 수용자에 대한 C-절편화를 수행하여 세포주 생산을 위한 태아를 회수하였다.
제2 형질감염/녹아웃 과정
제1 KO 벡터가 이미 "대립유전자 A"로 통합된 헤미-PrPKO 태아 섬유아세포 세포주의 형질감염을 하기와 같이 수행하였다. 소과 동물 태아 섬유아세포 배양에 사용한 배지는 알파 MEM (Gibco, 12561-049) 500 ml, 태아 소 혈청 (Hy-Clone ＃ABL13080) 50 ml, 페니실린-스트렙토마이신 (SIGMA) 5 ml 및 2-머캡토에탄올 (Gibco/BRL ＃21985-023) 1 ml를 함유하였다. 형질감염시키기 전일에, 세포를 현미경 조사에 의해 측정된 바로는 80-100％ 전면생장된 T175 조직 배양 플라스크에 시딩하였다. 형질감염시키는 당일에, 약 10 7 개의 소과 동물 섬유아세포 세포를 트립신으로 처리하고, 알파-MEM 배지로 1회 세척하였다. 세포를 알파-MEM 800 ㎕ 중에 재현탁한 후에, 1 mM 스페르미딘을 함유하는 HBS (Hepes 완충액 염수)에 이미 용해시킨 KO 벡터 (pBPrP(H)KOpuro 벡터) 30 ㎍을 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 세포-DNA 현탁액을 전기천공 큐벳으로 옮기고, 550 V 및 50 μF에서 전기천공하였다. 이어서, 전기천공된 세포를 혈청을 보충한 알파-MEM 배지가 포함된 30개의 48-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48 시간 동안 배양한 후에, 배지를 퓨로마이신 1 ㎍/ml를 함유하는 배지로 교체하고, 세포를 2 내지 3주 동안 배양하여 퓨로마이신 내성 세포를 선별하였다. 선별한 후에, 거의 100％ 전면생장된 모든 콜로니를 골라 2개의 복제 플레이트 (24-웰 및 48-웰 플레이트)에 분배하였다. 이 중 하나의 플레이트는 게놈 DNA 추출에 사용하고, 다른 플레이트는 핵 전달에 사용하였다. 게놈 DNA를 콜로니로부터 추출하여 PCR로 목적 상동성 재조합 반응에 대해 스크리닝하였다.
동종접합성으로 표적화된 통합에 대한 스크리닝
상기 기재된 바와 같이, 퓨어진 DNA 단리 키트 (Gentra Systems)를 제조업자의 프로토콜에 따라 독립적으로 사용하여 각각의 24-웰로부터 게놈 DNA를 독립적으로 추출하였다. 각각의 게놈 DNA 샘플을 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 20 ㎕ 및 1 mM EDTA (EDTA)에 재현탁하였다. PCR에 의한 스크리닝을 하기 프라이머 쌍을 사용하여 수행하였다: F14 ; 5'- TTG CTC CAC CTT CCG TCT TCT GTC-3' (서열 3) 및 R14 ; 5'- GTT GGC GCC TAC CGG TGG ATG TG-3' (서열 4). 하나의 프라이머 서열은 KO 벡터에 위치하고, 다른 프라이머의 서열은 표적화된 내인성 로커스에서 통합된 벡터 바로 외부에 위치한다 (도 1). 따라서, 예상되는 PCR 산물은 KO 벡터가 상동성 재조합에 의해 표적화된 로커스에 통합된 경우에만 검출된다. PCR 반응 혼합물은 물 17.0 ㎕, 10X LA PCR 완충액 II (Mg 2+ 첨가) 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol, 역방향 프라이머 10 pmol, 게놈 DNA 2 ㎕ 및 LA Taq 0.3 ㎕를 함유한다. 하기 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 PCR 30 주기를 수행하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10초 및 68 ℃에서 5 분 동안. PCR 후에, 반응 혼합물을 전기영동법에 의해 분석하였다. 332개의 클론을 스크리닝한 결과, 15개의 클론 (＃26, 86, 113, 116, 118, 173, 177, 213, 235, 250, 251, 266, 285, 318, 330)이 예상된 PCR 산물을 생성하였으며, 상기 PCR 산물을 서열화함으로써 이를 확인하였다. 다형성 서열을 기초로, KO 벡터가 모든 클론의 PrP 로커스의 엑손 3의 "대립유전자 B"에 통합되었음이 밝혀졌다. 8개의 클론을 핵 전달시켜 태아를 생성시켰고, #285로부터의 3개의 태아 (#1395, 1468, 1476) 및 #113으로부터의 7개의 태아 (#1439-1, 1439-2, 1487, 3583, 3632, 3682-1, 3682-2, 4961)는 puroKO 벡터 및 neoKO 벡터가 각각 "대립유전자 B" 및 "대립유전자 A"에 통합된 동종접합성 PrP KO임이 입증되었다. 이어서, PrP 로커스의 두 대립유전자 모두가 KO 벡터에 의해 돌연변이된 10개의 소과 동물 섬유아세포 세포주가 성공적으로 생성되었다.
하기 표 1에는 반접합성 PrP KO 세포주로부터 유도된 동종접합성 PrP KO 클론을 이용한 염색질 전달 후의 임신에 관한 데이타를 요약하였다.
| 세포주 ID | 임신 여부를 조사한수용자의 수 | 제40일의 임신 수 (％) | 제90일의 임신 수 (％) |
| 1395 | 50 | 28 (56) | 17 (34) |
| 4661 | 23 | 13 (56) | 5 (22) |
| 1439 | 12 | 6 (50) | 4 (33) |
| 1487-1 | 14 | 10 (71) | 1 (7) |
| 대조군 6594 | 18 | 10 (56) | 8 (44) |
호모-PrP 태아에서 PrP 발현의 부재 증명
몇몇 태아로부터 섬유아세포를 확립하고, 총 RNA를 RNeasy 미니 키트 (퀴아젠)를 이용하여 추출하였다. 총 RNA 1 ㎕를 제1-가닥 cDNA 합성 (RT-PCR을 위한 슈퍼스크립트(SuperScript) 제1-가닥 합성 시스템; 인비트로겐)시킨 후, RT-PCR을 수행하였다. 하기와 같이 RT-PCR을 수행하였다. 사용한 프라이머는 5'-AAG AAG CGA CCA AAA CCT GG-3' 및 5'-GTA ACG GTG CAT GTT TTC ACG-3'이었다. PCR 반응 혼합물은 물 32.5 ㎕, 10X Ex Taq 완충액 (타카라(TAKARA)) 5 ㎕, dNTP 혼합물 8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol, 역방향 프라이머 10 pmol, 제1-가닥 cDNA 2 ㎕ 및 Ex Taq (타카라) 0.5 ㎕를 함유하였다. 하기 조건하에서 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 PCR 35 주기를 수행하였다; 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10초 및 62 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 1 분 동안. PCR 후에, 반응 혼합물을 전기영동법에 의해 분석하였다. 야생형 및 헤미-PrP KO 세포 모두에서 맑은 PCR 생성물이 검출된 반면, 10개의 호모-PrP KO 세포주 중 어디에서도 양성 PCR 생성물은 존재하지 않았다. 이 결과는 호모-PrP KO 세포주에서의 PrP 발현의 완벽한 부재를 증명한다.
실시예 2: HAC의 도입 및 재배열
HAC 삽입 절차의 요약
프리온 유전자의 하나 또는 두 대립유전자에 돌연변이를 갖고 이종 항체를 발현하는 유제동물 (예컨대, 소과 동물)의 생성을 위해, 표준 방법을 사용하여 세포에 이종 항체 (예를 들어, HAC)를 코딩하는 핵산을 삽입할 수 있다. 예를 들면, HAC를 프리온 유전자의 하나 또는 두 대립유전자가 불활성화되기 전 또는 후에 삽입할 수 있다. 원한다면, 하나 이상의 내인성 항체 유전자는 세포내에서 돌연변이될 수도 있다. 그 후, 세포를 표준 핵 전달 절차에 사용하여, 이하에 보다 상세하게 기재된 바와 같이 목적 트랜스제닉 유제동물을 생산한다.
본질적으로, 인간 인공 염색체 서열을 함유하는 수컷 및 암컷 소과 동물의 태아 섬유아세포 세포주 (예를 들어, #14fg., #2fg. 및 #22fg.)를 수득하고, 선별하고, 이를 사용하여 상기 세포주로부터 클로닝된 송아지를 생산하였다.
예를 들어, 인간 염색체 #14 (Ig 중쇄 유전자를 포함하는 "#14fg"), 인간 염색체 #2 (Ig 카파 쇄 유전자를 포함하는 "#2fg") 및 인간 염색체 #22 (Ig 람다 쇄 유전자를 포함하는 "#22fg")로부터 유도된 HAC를 동시에 또는 연속적으로 도입할 수 있다.
이러한 염색체 단편의 전달은 수컷 #14fg. 동물을 암컷 #2fg. 및 #22fg. 동물과 교배시키고 자손을 평가함으로써 시험하였다. 전달에 성공하면 두 계통을 교배하여 3종의 염색체 단편 모두를 함유하는 계통을 생산하였다.
또한, #14fg., #2fg. 및 #22fg. 염색체 단편을 태아 세포 (예를 들어, 트랜스제닉 호모 H/L 태아 세포)에 삽입하고, 이것을 사용하여 클로닝된 송아지를 생성시키거나 트랜스제닉 HAC 송아지를 다른 트랜스제닉 송아지 (예를 들어, 호모 H/L 송아지)와 교배시켰다. 별법으로, 다른 HAC, 예컨대 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 이하에 기재된 바와 같이 도입하거나 또는 다른 임의의 염색체 전달 방법을 사용하여 도입할 수 있다.
이론적 근거
HAC를 생식선에 전달하는 것은 HAC를 동물 (예를 들어, Ig 유전자결손 동물)에 도입하고 동물을 대량 생산하는데 유용할 것이다. 생식선을 통한 HAC의 전파에서의 관심사는 감수분열 중의 염색체 물질의 불완전한 짝짓기이다. 그러나, 문헌 [Tomizuka et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 722, 2000]에 나타난 바와 같이 마우스에서의 생식선 전달은 성공적이었다.
도 1A에 약술된 전략은 #14fg.를 수컷 세포주에 삽입하고 #2fg. 및 #22fg.를 각각 암컷 세포주에 삽입하는 것으로 이루어진다. HAC를 보유하는 송아지를 생산하고 암컷 및 수컷 둘 다에서 생식선 전달을 시험할 수 있다. 태어난 자손의 일부 (약 25％)는 중쇄 및 경쇄 HAC 둘 다를 함유해야 한다. 추가 교배에 의해 3종의 염색체 단편을 모두 함유하는 송아지 계통이 형성되야 한다. 이 동물들을 임의로 종래에 기재된 바와 같은 태아 세포로부터 생산된 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 호모 H/L 동물)과 교배시키는데 사용한다.
실험 설계
세포주를 새로 스크리닝하여 세포를 수득하였다. 이들은 홀스타인이거나, 상기 사용된 것과 상이한 세포주일 수 있다. 이 세포주는 가능한 한 많은 유전적 변이를 유지하면서 교배할 수 있도록 한다. 이어서, HAC를 세포주로 도입하고 양성 세포주를 선별하였다. 선별한 세포주를 사용하여 핵을 전달하고 송아지를 생산하였다. 12월령에서 출발하여 정자 및 난자를 수집하고, 수정시키고, 수용자 동물에 전달하였다. DNA 마커 분석 및 핵형분석을 위해 세포 샘플을 채취하였다. 출생시부터 혈액 샘플을 채취하여 인간 Ig 단백질의 존재에 대해 분석하였다.
상기 지시된 바와 같이, 또한 상기 실험에서 개발된 절차를 사용하여 HAC를 호모 H/L 세포주에 임의로 전달하였다.
하기 실시예는 본 발명을 더 상세하게 예시하기 위해 추가로 제공된다.
HAC 삽입의 예시적인 절차
이종 (예를 들어, 인간) 이뮤노글로불린 중쇄 (뮤) 및 람다 경쇄가 소과 동물 숙주에 의해 단독으로 또는 조합으로서 생산될 수 있는지 입증하기 위해 추가 실험을 실시하였다. 또한, 이 실험들은 인간 이뮤노글로불린 쇄가 재배열되고 폴리클로날 혈청이 수득되었음을 입증하였다. 상기 절차에서, 인간 인공 염색체를 사용하여 이뮤노글로불린-발현 유전자를 소과 동물 섬유아세포에 도입하였다. 이어서, 섬유아세포를 이용하여 핵을 전달하고, 태아를 수득하고 항체 생산에 대해 분석하였다. 이러한 절차 및 결과를 이하에 더욱 상세하게 기재하였다. 프리온 유전자의 하나 또는 두 대립유전자에 돌연변이가 있는 태아로부터 단리된 섬유아세포 및 HAC의 도입에 대해 하기 기재한 방법에서 사용한 섬유아세포로부터도 유사한 결과가 기대된다. 별법으로, HAC를 세포로 도입시킬 수 있고, 그 후 돌연변이체를 (i) HAC를 가진 세포의 프리온 유전자로 또는 (ii) HAC를 가진 세포를 사용하여 생성된 클로닝된 태아로부터의 세포의 프리온 유전자로 도입시킬 수 있다.
HAC 구조물
종래에 기재된 염색체-클로닝계 [Kuroiwa et al., Nature Biotech. 18: 1086-1090, 2000]를 사용하여 인간 인공 염색체 (HAC)를 제작하였다. 요약하면, ΔHAC의 제작을 위해, HCF2 로커스에서 통합된 loxP 서열을 함유하는 종래에 보고된 인간 염색체 22 단편 (hChr22)을 텔로미어-지향성 염색체 절단 [Kuroiwa et al., Nucleic Acid Res., 26: 3447-3448, 1998]에 의해 AP000344 로커스에서 절단하였다. 이어서, 상기 AP000344 로커스에서 절단된 hChr22 단편 (hCF22)을 함유하는 DT40 세포 클론을 안정하고 생식선-전달가능한 인간 미니염색체 SC20 벡터를 함유하는 DT40 세포 클론 ("R 클론"으로 지칭됨)과 융합시켜 세포 하이브리드를 형성시켰다. SC20 벡터는 S20 단편의 RNR2 로커스에 loxP 서열을 삽입하여 생성하였다. SC20 단편은 인간 Ig 중쇄 유전자의 전체 영역을 포함하는 인간 염색체 14로부터 유도된 자연 발생 단편이다 [Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 722, 2000]. 생성된 DT40 세포 하이브리드는 두 hChr 단편을 함유하였다. DT40 하이브리드를 Cre 리컴비나제-발현 벡터와 함께 형질감염시켜 hCF22와 SC20 벡터 사이에 Cre/loxP-매개성 염색체 전위를 유도하였다. SC20 벡터내의 loxP-클로닝 위치에 HCF2 및 AP000344 로커스에 의해 정의되는 2.5 Mb hChr22 영역이 클로닝되었는지 확인하기 위해 안정한 형질감염체를 네스티드 PCR을 사용하여 분석하였다. 이어서, ΔHAC를 함유하는 것으로 기대되는 PCR-양성 세포를 코딩된 녹색 형광 단백질의 형광을 기준으로 하는 FACS 분류에 의해 단리하였다. 또한 분류된 세포의 형광 원위치 혼성화 (FISH) 분석을 사용하여 2.5 Mb hChr22 삽입물을 함유하는 ΔHAC의 존재를 확인하였다.
유사하게, 상기 염색체-클로닝계를 사용하여 ΔΔHAC도 또한 제작하였다. hChr22 단편을 AP000344 로커스에서 절단한 후에, DT40 세포내에서 상동 재조합에 의해 loxP 서열을 AP000553 로커스내에 통합시켰다. 이어서, 생성된 세포를 SC20 미니염색체 벡터를 함유하는 R 클론과 융합하였다. 세포 하이브리드를 Cre-발현 벡터로 형질감염시켜 Cre/loxP-매개성 염색체 전위를 허용하였다. AP000553 및 AP000344 로커스에 의해 정의되는 1.5 Mb hChr22 삽입물을 함유하는 ΔΔHAC의 생성을 PCR 및 FISH 분석에 의해 확인하였다.
ΔHAC 및 ΔΔHAC의 생체내 기능을 이러한 HAC를 함유하는 키메라 마우스의 생성에 의해 평가하였다. 이들 HAC들을 개별적으로 마우스 배아 줄기 (ES) 세포내에 도입한 후에, 표준 절차 (2000년 5월 11일자 출원된 일본 특허 제2001-142371호)를 사용하여 키메라 마우스를 생성하였다. 생성된 마우스는 고도의 키메라증 (털색의 85-100％)을 보였으며, 이것은 이 HAC를 함유하는 ES 세포의 전능성 및 이 HAC의 생체내 유사분열 안정성의 수준이 매우 높음을 입증하는 것이다. 또한, ΔHAC가 ΔHAC 키메라 마우스의 생식선을 통해 다음 자손에게 전달된 것은 이 HAC의 감수분열 안정성을 입증하는 것이다.
이 HAC들을 보유하는 닭 DT40 세포는 2001년 5월 9일자로 부다페스트 협약에 의거 하여 인터내셔널 페이턴트 오르가니즘 디파지터리, 내셔널 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀러지 (International Patent Organism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan)에 기탁되었다. 기탁 번호는 하기와 같다: ΔHAC (FERM BP-7582), ΔΔHAC (FERM BP-7581) 및 SC20 단편 (FERM BP-7583). 이 HAC들을 보유하는 닭 DT40 세포는 또한 대만의 푸드 인더스트리 리써치 앤드 디벨로프먼트 인스티튜트 (Food Industry Research and Development Institute (FIRDI))에 기탁되었다. 기탁 번호 및 날짜는 하기와 같다: ΔHAC (CCRC 960144; 2001년 11월 9일), ΔΔHAC (CCRC 960145; 2001년 11월 9일) 및 SC20 단편 (세포주는 SC20 (D)라는 명칭으로 기탁됨; CCRC 960099; 1999년 8월 18일).
ΔHAC 중의 2.5 Mb hChr22 삽입물은 진뱅크 승인 번호로 열거된 하기 BAC 콘티그로 구성된다:
ΔΔHAC 중의 1.5 Mb hChr22 삽입물은 하기 BAC 콘티그로 구성된다:
소과 동물의 태아 섬유아세포의 생성
소과 동물의 태아 섬유아세포를 생성하기 위해, 암수 부모의 가계를 3 세대 연속으로 기록했고 Trans Ova (아이오와)에서 사육한 질병-시험된 홀스타인 또는 저지(Jersey) 종 암소로부터 제45일 내지 제60일의 태아를 수집하였다. 수집한 태아들은 일차 태아 섬유아세포의 생성을 위해 얼음포장하여 헤마테크 워세스터 분자생물학부 (Hematech's Worcester Molecular Biology Division)로 운송하였다. 도착 후, 조직 배양 후드내에서 태아들을 비-조직 배양 등급의 100 mm 플라스틱 페트리 접시에 전달하였다. 멸균 포셉 및 가위를 사용하여 배아의 외막 및 탯줄을 태아로부터 제거하였다. 태아를 새로운 플라스틱 페트리 접시에 옮기고, 머리, 사지, 내장 기관들을 제거하였다. 내장을 들어낸 태아를 하기 조성의 태아 세정액 대략 10 ml를 함유하는 제3의 페트리 접시에 옮겼다: Ca 2+ 및 Mg 2+ 를 함유하는 1× 둘베코스(Dulbecco's)-PBS (D-PBS) (Gibco-BRL, cat#. 14040) 125 ml; 틸로신 타르트레이트(Tylosine Tartrate) (8 mg/ml, Sigma, cat#. T-3397) 0.5 ml; 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma, cat#. P-3539) 2 ml; 및 펀지존(Fungizone) (Gibco-BRL, cat#. 15295-017) 1 ml (혼합하고 0.2 ㎛ 나일론 필터 단위 (Nalgene, cat#. 150-0020)를 통해 여과함).
각 태아를 태아 세정액으로 3회 더 세척하여 혈흔을 제거하고, 50 ml 원뿔형 조직 배양 튜브에 넣고, 멸균 외과용 메스로 작은 조각으로 잘게 저몄다. 조직 조각들을 Ca 2+ 및 Mg 2+ 를 함유하지 않는 1×D-PBS (Gibco-BRL, cat#. 14190)로 1회 세척하였다. 조직 조각들이 튜브 바닥에 정착된 후에, 상등액을 제거하고 세포 해리 완충액 (Gibco-BRL, cat#. 13151-014) 대략 30 ml로 교환하였다. 튜브를 수회 뒤집어 혼합하고 조직 배양 인큐베이터내에서 38.5 ℃/5％ CO 2 에서 20 분 동안 인큐베이션하였다. 조직을 튜브 바닥에 정착시킨 후에, 상등액을 제거하고, 동등한 부피의 새로운 세포 해리 완충액으로 교환하였다. 조직과 세포 해리 완충액 혼합물을 24 mm의 모서리가 둥근 스핀 바가 들어 있는 멸균된 75 ml 유리 트립신화 플라스크 (Wheaton Science Products, cat#. 355393)로 옮겼다. 플라스크를 38.5 ℃/5％ CO 2 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 자석 교반판 위에 놓고, 효율적으로 혼합되도록 충분한 속도로 대략 20 분 동안 교반하였다. 플라스크를 조직 배양 후드에 옮기고, 조직 조각들이 정착된 후에, 상등액을 제거하고, 1,200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 해리된 세포들을 수확하였다. 세포 펠릿을 알파 MEM (BioWhittaker, cat#. 12-169F) 440 ml; 방사선 조사된 소과 동물의 태아 혈청 50 ml; GLUTAMAX-I 보충제 (Gibco-BRL, cat#. 25050-061) 5 ml; 페니실린-스트렙토마이신 (Sigma, cat#. P-3539) 5 ml; 2-메르캅토에탄올 (Gibco-BRL, cat#. 21985-023) 1.4 ml (소과 동물 태아 혈청을 제외한 모든 성분을 혼합하고 0.2 ㎛ 나일론 필터 단위 (Nalgene, cat#. 150-4020)를 통해 여과함)로 조성된 작은 부피의 완전한 섬유아세포 배양 배지에 재현탁하고, 얼음에 보관하였다. 각 단계마다 세포 해리 용액 30 ml를 첨가하여 해리 과정을 3회 더 반복하였다. 세포들을 모아서 완전한 섬유아세포 배지에서 세척하고, 23 및 26 게이지 바늘을 차례로 통과시키고, 최종적으로 70 ㎛ 세포 여과기 (BD Falcon, cat#. 352350)를 통과시켜 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 트리판 블루 (0.4％ 용액, Sigma, cat#. T-8154)의 존재하에서 혈구계로 계수하여 세포의 밀도 및 생존능을 측정하였다.
일차 섬유아세포를 38.5 ℃/5％ CO 2 인 완전한 섬유아세포 배지에서 T75 ㎠ 조직 배양 플라스크당 세포 밀도를 1×10 6 생존 세포로 하여 확장시켰다. 배양한지 3 일 후 또는 세포가 전면생장에 도달하기 전에, 플라스크를 1×D-PBS (Ca 2+ 및 Mg 2+ 를 함유하지 않음)로 세정하고 실온에서 5 내지 10 분 동안 세포 해리 완충액 10 ml와 함께 인큐베이션하여 섬유아세포를 수확하였다. 도립현미경을 사용하여 세포의 박리를 시각적으로 모니터링하였다. 이 단계에서, 연화처리하여 세포 응괴가 확실히 흩어지도록 주의를 기울였다. 해리된 섬유아세포를 세척 및 정량한 후에, 유전자 표적화 실험에 사용하도록 준비하였다. 이 세포들은 또한 장기 보존을 위해 냉동보존할 수 있다.
소과 동물 태아 섬유아세포내로의 HAC의 도입
미소세포-매개성 염색체 전달법 (MMCT) (Kuroiwa et al. Nature Biotech. 18: 1086-1090, 2000)을 사용하여 ΔHAC 및 ΔΔHAC를 DT40 세포 하이브리드로부터 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포로 전달하였다. ΔHAC ("D15 클론")를 함유하는 CHO 클론을 37 ℃ 및 5％ CO 2 에서 10％ FBS (Gibco), G418 1 mg/ml 및 히그로마이신 B 0.2 mg/ml로 보충된 F12 (Gibco) 배지에서 배양하였다. D15 클론을 12개의 T25 플라스크에 확장시켰다. 전면생장이 80-90％에 도달했을 때, 콜세미드 (Sigma)를 최종 농도가 0.1 ㎍/ml가 되도록 배지에 첨가하였다. 3 일 후에, 배지를 사이토칼라신 B (Sigma) 10 ㎍/ml로 보충된 DMEM (Gibco)으로 교환하였다. 플라스크를 8,000 rpm에서 60 분 동안 원심분리하여 미소세포를 수집하였다. 미소세포를 8, 5, 및 3-㎛ 필터 (Costar)로 정제한 후에, DMEM 배지에 재현탁하였다. 이하에 기재된 바와 같이 미소세포를 사용하여 소과 동물 섬유아세포와 융합하였다.
소과 동물의 태아 섬유아세포를 37 ℃ 및 5％ CO 2 에서 10％ FBS (Gibco)로 보충된 α-MEM (Gibco) 배지에서 배양하였다. 섬유아세포를 T175 플라스크에서 확장시켰다. 전면생장이 70-80％에 도달했을 때, 0.05％ 트립신을 사용하여 세포를 플라스크로부터 박리하였다. 섬유아세포를 DMEM 배지로 2회 세척한 후에, 미소세포 현탁액상에 덮었다. 미소세포-섬유아세포 현탁액을 1,500 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 후에, PEG1500 (Roche)을 사용설명서에 따라 펠릿에 첨가하여 미소세포가 소과 동물 섬유아세포와 융합할 수 있도록 하였다. 융합된 후에, 융합된 세포를 6개의 24-웰 플레이트에 플레이팅하고 24 시간 동안 10％ FBS로 보충된 α-MEM 배지에서 배양하였다. 이어서, 배지를 0.7 mg/ml G418을 함유하는 배지로 교환하였다. 약 2 주 동안 G418 항생제의 존재하에서 성장시킨 후에, G418 내성을 갖는 융합 세포를 선별하였다. 이러한 G418-내성 클론을 이하에 기재된 바와 같이 핵 전달에 사용하였다.
유사하게, CHO 클론 C13으로부터의 ΔΔHAC를 MMCT에 의해 소과 동물 태아 섬유아세포에 전달하였다. 선별된 G418-내성 클론을 핵 전달에 사용하였다.
핵 전달, 활성화 및 배아 배양
핵 전달 절차를 본질적으로 종래에 기재된 바와 같이 실시하였다 [Cibelli et al., Science 1998: 280:1256-1258]. 시험관내 성숙된 난모세포를 약 18-20 성숙 후 시간 (hour post maturation, hpm)에 핵제거하고, UV광하에서 비스벤지미드 (회흐스트 33342, Sigma) 표지로 염색체가 제거된 것을 확인하였다. 세포질체-공여자 세포 쌍을 2.4 kV/cm의 단일 전기 펄스를 20 μ초 동안 사용하여 (Electrocell manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA) 융합시켰다. 3-4 시간 후, 전체 전달된 쌍 중에서 25％의 무작위 서브세트가 제거되었고, 전달된 핵을 비스벤지미드 표지하여 융합을 확인하였다. 종래에 기재된 바와 같이, 30 hpm에 재구성된 난모세포 및 대조군을 칼슘 이오노포어(5 μM) (Cal Biochem, San Diego, CA)로 4 분 동안 및 ACM 배양 배지 중의 시클로헥시미드 10 ㎍ 및 사이토칼라신 D (Sigma) 2.5 ㎍으로 6 시간 동안 활성화시켰다 [Lin et al., Mol. Reprod. Dev. 1998: 49:298-307; Presicce et al., Mol. Reprod. Dev. 1994: 38:380-385]. 활성화된 후에, 난자를 HEPES 완충된 햄스터 배아 배양 배지 (HECM-Hepes)로 5회 세척하고, 방사선 조사된 마우스 태아 섬유아세포 및 배아 시험된 미네랄 오일 (Sigma) 0.2 ml로 덮인 배아 배양 배지 0.5 ml를 함유하는 4-웰 조직 배양 플레이트에 넣었다. 각각의 웰에 25 내지 50개의 배아를 넣고 대기 중 5％ CO 2 , 38.5 ℃에서 인큐베이션하였다. 제4일에 10％ FCS를 배양 배지에 첨가하였다.
배아 전달
제7일 및 제8일에 핵 전달 포배를 각각 제6일 및 제7일에 동기화된 수용자 어린 암소 (heifer)에게 전달하였다. 루탈리스(Lutalyse) (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, MI)를 단회 주사한 후에 발정을 검출하여 수용자 동물을 동기화하였다. 배아 전달 후 제30일 및 제60일에 수태물의 존재를 초음파촬영한 후에, 270일까지 30일 마다 직장내 촉진에 의해 수용자를 검사하였다. 이 소과 동물의 태아들에서 HAC의 보유를 표 2에 요약하고 이하에 더 상세하게 기재하였다.
염색체 #14 단편을 함유하는 HAC의 도입
SC20 단편, 인간 염색체 #14 단편 (Ig 중쇄 유전자를 함유하는 "hchr.14fg")을 상기 기재된 바와 실질적으로 동일한 방식으로 태아 섬유아세포에 도입하였다. 또한, 다른 임의의 표준 염색체 전달 방법을 사용하여 이 HAC 또는 인간 Ig 유전자를 함유하는 또 다른 HAC를 공여자 세포로 삽입할 수 있다. 생성된 공여자 세포는 HAC를 갖는 트랜스제닉 유제동물을 생성하기 위한, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 표준 핵 전달 기술에 사용될 수 있다.
hchr.14fg를 함유하는 세포로부터 클로닝된 배아를 전달받은 28 마리 수용자의 임신 상태를 초음파촬영술로 확인하였다. 결과를 표 3에 요약하였다.
원한다면, 생성된 HAC 태아 또는 HAC 자손으로부터의 세포를 핵 전달의 제2 라운드에 사용하여 추가의 클로닝된 자손을 생성할 수 있다. 최초 HAC 태아 또는 HAC 자손으로부터의 세포는 또한 추가의 HAC 유제동물의 생성을 위한 공여자 세포의 공급원으로 사용하기 위한 세포주를 형성하기 위해 냉동시킬 수 있다.
임신율은 예상보다 낮았다. 이것은 배아 전달시의 비정상적으로 더운 날씨 때문으로 생각된다.
도 27에 예시한 바와 같이, HAC를 갖는 배아의 임신율은 비-트랜스제닉 클로닝된 경우의 임신율과 동등한 것으로 보인다. ΔΔHAC 송아지를 갖는 한 수용자는 최근에 살아 있는 건강한 송아지를 낳았다. 나머지는 다음 수 개월 이내에 태어날 것이다.
ΔHAC 소과 동물의 태아에서 인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현의 입증
클로닝된 ΔHAC-트랜스제닉 소과 동물의 태아를 다양한 임신기간에 제거하고, 인간 이뮤노글로불린 로커스의 존재, 재배열 및 발현에 대해 분석하였다. 상기 태아 중 하나의 비장 및 비림프양 조직 (간 및 뇌)으로부터 RT-PCR에 의해 수득한 게놈 DNA 및 cDNA의 분석은 ΔHAC의 존재, 재배열 및 발현을 나타냈다.
ΔHAC 태아에서 인간 중쇄 및(또는) 경쇄의 존재
ΔHAC 태아내에 인간 중쇄 및 경쇄가 보유되어 있는지 결정하기 위해, ΔHAC 태아로부터 간 DNA를 단리하고, PCR에 의해 인간 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 게놈 DNA의 존재를 분석하였다.
게놈 중쇄 DNA를 검출하기 위해, 사용한 프라이머는 VH3-F 5'-AGT GAG ATA AGC AGT GGA TG-3' (서열 1) 및 VH3-R 5'-CTT GTG CTA CTC CCA TCA CT-3' (서열 2)이었다. 람다 경쇄 DNA의 검출에 사용한 프라이머는 IgL-F 5'-GGA GAC CAC CAA ACC CTC CAA A-3' (서열 3) 및 IgL-R 5'-GAG AGT TGC AGA AGG GGT YGA CT-3' (서열 4)이었다. PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, 게놈 DNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 반응 혼합물을 하기 조건하에서 인큐베이션하여 38 주기의 PCR을 실시하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 56 ℃에서 30 초, 및 72 ℃에서 30 초 동안.
도 5에 나타낸 바와 같이, 태아 #5968, 6032 및 6045는 각각 인간 중쇄 (μ) 및 경쇄 (λ) 로커스를 둘 다 함유하였다. 태아 #5996은 인간 중쇄 로커스만을 함유하였다. 태아 #5983은 인간 중쇄를 함유하지 않았고, 인간 경쇄를 함유하지 않을 수 있었다. 태아 #5846은 어떠한 인간 서열도 함유하지 않았다. 따라서, 태아 #5983 및 5846은 ΔHAC를 보유하지 않을 수 있었다. 이러한 결과는 ΔHAC가 소과 동물에서 임신 제58일까지 안정하게 보유될 수 있음을 시사한다.
ΔHAC 태아 #5996에서 인간 Cmu 엑손의 존재
Cmu 3 및 Cmu 4의 부분을 포함하는 mRNA 전사체에 특이적인 프라이머를 사용하여 ΔHAC의 존재 및 태아 #5996의 인간 뮤 로커스의 불변 영역을 코딩하는 전사체의 발현을 측정하였다.
상기 인간 뮤 중쇄의 게놈 불변 영역의 RT-PCR 분석을 위해, 프라이머 "CH3-F1"
및 "CH4-R2" 를 사용하여 350 염기쌍의 RT-PCR 생성물을 생성시켰다. 상기 PCR 증폭은 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하여 변성시킴으로써 개시되었다. 이어서, 95 ℃에서 1 분, 59 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하여 35 주기의 변성, 어닐링 및 증폭을 실시하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 재배열된 소과 동물 중쇄를 이하에 기재된 바와 같이 프라이머 I7L 및 P9를 사용하여 검출하였다 (도 7). 내부 대조군으로서, GAPDH RNA의 수준을 프라이머 "GAPDH 정방향" 및 "GAPDH 역방향" 을 사용하여 검출하였다. 상기 GAPDH RNA의 증폭을 위해, 샘플을 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 후에, 35 주기에 걸쳐 95 ℃에서 1 분, 55 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 72 ℃에서 7 분 동안 인큐베이션하였다.상기 분석은 태아 #5996의 비장의 RT-PCR 분석이 대조군 인간 비장 cDNA (레인 4) 및 ΔHAC 키메라 마우스로부터 수득한 cDNA (레인 5)를 사용하여 생성시킨 증폭 생성물과 매칭되는 밴드 (레인 3)를 생성하였음을 나타냈다 (도 6). 비림프모양 조직인 소과 동물 간 (레인 1) 또는 소과 동물 뇌 (레인 2)에서는 상기와 같은 밴드가 검출되지 않았다. 간 (도 6의 레인 10) 및 뇌 (도 7의 레인 6) 둘 다에서의 하우스키핑 유전자, GADPH의 성공적인 증폭은 상기 조직들이 RT-PCR을 지지하는 능력을 나타냈다.
임신 제77일까지의 소과 동물의 중쇄 로커스의 재배열
ΔHAC 태아 #5996을 시험하여 이뮤노글로불린 중쇄 로커스의 재배열에 요구되는 재조합계의 발현 및 활성화에 필요한 발생 과정을 수행하는지 결정하였다. 상기 분석을 위해, 표준 RT-PCR 분석을 실시하여 mu-VH 재배열을 코딩하는 mRNA 전사체의 존재를 검출하였다. 태아 #5996의 비장, 간 및 뇌로부터 단리한 RNA를 프라이머 "17L"
및 "P9" 를 사용하여 RT-PCR 분석하였다. PCR 반응 혼합물을 95 ℃에서 3 분 동안 인큐베이션한 후에, 하기 조건을 사용하여 35 주기의 변성, 어닐링 및 증폭을 실시하였다: 95 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 2 분. 이어서, 반응 혼합물을 72 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.도 7의 레인 5는 재배열된 소과 동물 중쇄 (450 염기쌍)의 증폭에 예상되는 크기의 생성물이 수득되었음을 나타낸다. 이 생성물은 재배열된 소과 동물 중쇄 전사체에 상응하는 서열을 함유하는 것으로 공지된 대조군 소과 동물 Cmu 중쇄 cDNA (레인 7)와 동등한 위치로 이동하였다. 예상한 바와 같이, 발생상의 이 시점에서 재배열된 중쇄는 비장 (레인 5)에서는 발현되었으나, 뇌 (레인 2) 및 간 (레인 3)에서는 발현되지 않았다.
ΔHAC 태아 #5996에서 인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현
인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현을 Cmu 및 VH 영역의 부분을 포함하는 DNA 절편의 증폭에 의해 입증하였다. Cmu (Cmu1) 및 VH (VH3-30)의 부분을 포함하는 RNA 전사체에 특이적인 프라이머를 사용하여 재배열된 인간 Cmu-VDJ 서열을 함유하는 RNA 전사체가 존재하는지 결정하였다 (도 8).
상기 RT-PCR 분석을 위해, 프라이머 "Cmu1"
및 "VH3-30" 을 사용하여 450 염기쌍의 RT-PCR 생성물을 생성시켰다. 상기 RT-PCR은 반응 혼합물을 95 ℃에서 3 분 동안 인큐베이션한 후에, 95 ℃에서 30 분, 69 ℃에서 30 분, 72 ℃에서 45 분 동안 40 주기에 걸쳐 인큐베이션하고, 72 ℃에서 10 분 동안 1 주기 인큐베이션하여 실시하였다. 이어서, 상기 RT-PCR 생성물을 동일한 프라이머로 95 ℃에서 3 분 동안 1 주기 인큐베이션하고, 95 ℃에서 1 분, 59 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분 동안 40 주기에 걸쳐 인큐베이션하고, 72 ℃에서 10 분 동안 1 주기 인큐베이션하여 재증폭시켰다. 내부 대조군으로서, 상기 기재된 바와 같이 GAPDH를 RT-PCR 증폭시켰다.도 8의 겔은 태아 #5996으로부터의 비장의 RT-PCR 분석이 인간 비장 cDNA (레인 4) 또는 ΔHAC 키메라 마우스 비장 cDNA (레인 1)를 사용하여 생성한 증폭 생성물과 매칭되는 밴드 (레인 5)를 생성하였음을 나타낸다. 소과 동물의 간 (레인 2) 또는 소과 동물의 뇌 (레인 3)에서는 이러한 밴드가 검출되지 않았다. 양성 대조군으로서, GADPH RNA (레인 8 및 9)를 증폭시킨 결과 상기 조직이 RT-PCR을 지지하는 능력을 나타냈다.
태아 #5996에서 인간 중쇄 영역의 재배열 및 발현도 또한 프라이머 CH3-F3
및 CH4-R2 를 사용하는 RT-PCR 분석에 의해 입증되었다. 상기 PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, cDNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 반응 혼합물을 하기 조건하에서 40 주기에 걸쳐 인큐베이션하여 PCR을 실시하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초.도 9의 레인 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 태아 #5996의 비장으로부터 증폭된 서열은 2개의 양성 대조군 (인간 비장 (레인 8) 및 ΔHAC 키메라 마우스 비장 (레인 9)으로부터의 샘플)으로부터의 스플라이싱된 불변 영역 단편과 동일한 크기였다. 예상한 바와 같이, 정상 마우스 비장 및 소과 동물 비장으로부터의 음성 대조군은 증폭된 서열을 함유하지 않았다 (레인 1 및 2). 태아 #5996의 간 및 뇌로부터의 샘플은 스플라이싱된 인간 뮤 중쇄 불변 영역 단편과 동일한 크기의 증폭된 스플라이싱된 서열을 함유하지 않았으나, RNA 샘플을 오염시키는 게놈 DNA로부터 유도된 스플라이싱되지 않은 게놈 단편의 증폭된 서열을 함유하였다 (레인 3,4 및 5).
ΔHAC 태아에서 인간 중쇄 로커스의 VDJ 재배열
또한, ΔHAC 태아 #5996의 중쇄 로커스에서 VDJ 재배열을 더 입증하기 위해 RT-PCR 분석을 실시하였다. 제1 반응에는 프라이머 Cmu-1
, 제2 반응에는 프라이머 Cmu-2 를 사용하고 두 반응 모두 프라이머 VH3-30.3 을 사용하여 네스티드 RT-PCR을 실시하였다. RT-PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, cDNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 제1 반응은 하기 조건하에서 38 주기에 걸쳐 RT-PCR을 실시하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 65 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초. 제2 반응은 하기 조건하에서 38 주기에 걸쳐 RT-PCR을 실시하였다: 프라이머 VH3-30.3 및 Cmu-2 를 사용하여 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 65 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초.도 10의 레인 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 태아 #5996의 비장의 RT-PCR 분석에 의해 레인 8 및 9의 양성 대조군과 동일한 크기의 중쇄 밴드가 생성되었다. 태아 #5996의 간 및 뇌로부터의 샘플은 약간의 재배열된 DNA 오염물을 함유하였다 (레인 3 및 5). 레인 1 및 2의 음성 대조군은 부정확한 크기의 밴드를 생성하였다.
시퀀싱에 의한 ΔHAC 재배열의 확인
ΔHAC 태아 #5996의 비장으로부터의 RNA를 역방향 전사시켜 수득한 cDNA를 재배열된 인간 뮤에 특이적인 프라이머로 증폭시키고 아가로스 겔에서 전기영동하였다. Cmu1-VH3-30 프라이머 쌍으로 증폭시켜 생성한 밴드를 겔로부터 잘라냈다. 증폭된 cDNA를 밴드로부터 회수하고, 클로닝하였다. 생성된 재배열된 인간 뮤에 대해 PCR-양성인 클론으로부터의 DNA를 정제하고, 시퀀싱하였다 (도 11A).
상기 ΔHAC 태아로부터의 서열은 20개 초과의 공지된 인간 중쇄 서열과 95％ 넘게 상동성이었다. 예를 들어, 인간 항-폐렴구균 항체의 뮤 쇄는 상기 서열의 영역과 97％ 상동성이었다 (도 11B).
또한, 태아 #5996의 비장을 프라이머 Cmu-1 및 VH3-30.3을 사용하여 RT-PCR 분석한 후에, 프라이머 Cmu-2 및 VH3-30.3을 사용하여 재증폭시켜 재배열된 인간 중쇄로부터의 추가 서열도 수득하였다. CHROMA SPIN 컬럼 (CLONETECH)을 사용하여 RT-PCR 생성물을 정제하고, 사용설명서에 따라 pCR2.1 TA-클로닝 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 다이 터미네이터(Dye Terminator) 서열 반응 (ABI Applied System)을 빅다이 터미네이터(BigDye Terminator) 반응 혼합물 (3 ㎕), 주형 플라스미드 (200 ng) 및 Cmu-2 프라이머 (1.6 pmol)로 조성된 반응 혼합물 10 ㎕ 부피 중에서 실시하였다. ABI 3700 시퀀서를 사용하여 시퀀싱 반응을 실시하였다. 이 분석을 위해, 하기 조건하에서 25 주기를 실시하였다: 96 ℃에서 1 분, 96 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 5 초 및 60 ℃에서 4 분.
2개 이상의 재배열된 인간 중쇄 전사체를 확인하였으며, 이들은 VH3-11/D7-27/JH3/Cμ 및 VH3-33/D6-19/JH2/Cμ였다 (도 12A 및 12B). 이러한 결과는 인간 뮤 중쇄 로커스의 VDJ 재배열이 태아 #5996의 비장내의 ΔHAC에서 일어남을 입증하는 것이다. 동일한 태아로부터 하나 이상의 재배열된 중쇄 서열을 확인한 것은 또한 ΔHAC 태아가 다양한 인간 이뮤노글로불린 서열을 생성할 수 있음을 입증하는 것이다.
ΔΔHAC 태아에서 인간 중쇄 및 경쇄 로커스의 재배열 및 발현
ΔΔHAC에 대한 트랜스염색체가 있는 소과 동물의 태아 섬유아세포로부터 유도된 클로닝된 태아를 다양한 임신기간의 수용자 암소로부터 제거하였다. 태아를 HAC성 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 람다 경쇄 로커스의 존재 및 재배열에 대해 분석하였다. 상기 조직으로부터의 게놈 DNA 연구는 일부 태아에서 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 존재를 가리켰다. 상기 태아의 비장으로부터 유도된 cDNA를 검사한 결과는 상기 태아의 일부에서 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 로커스의 재배열 및 발현을 가리켰다. FACS 분석도 또한 태아들 중 2개에서 비장 림프구 표면상에서의 인간 람다 경쇄 단백질의 발현을 입증하였다.
ΔΔHAC 태아에서 인간 중쇄 및 경쇄 로커스의 존재
ΔΔHAC 태아가 인간 중쇄 및 경쇄 로커스를 보유하는지 결정하기 위해, 제58일의 태아 #5580, 제57일의 태아 #5848 및 제91일의 태아 #5442A 및 5442B의 간으로부터의 게놈 DNA에 대해 PCR 분석을 실시하였다. 중쇄 로커스의 검출에 사용된 PCR 프라이머는 VH3-F
및 VH3-R 이었고, 경쇄의 검출에 사용된 프라이머는 IgL-F 및 IgL-R 이었다. PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, 게놈 DNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 하기와 같이 38 주기의 PCR을 실시하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 56 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초 (도 13 및 14).도 13 및 14에 예시한 바와 같이, 양성 대조군인 제58일 태아 #5580은 인간 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 로커스를 둘 다 함유하였다. 또한, 제91일 태아 #5442A 및 5442B도 중쇄 및 경쇄 로커스를 둘 다 함유하였다 (도 14). 반대로, 태아 #5848은 인간 로커스를 함유하지 않았고, ΔΔHAC를 함유하지 않았을 수 있었다. 이러한 결과는 ΔΔHAC가 소과 동물에서 임신 제91일까지 안정하게 보유될 수 있음을 시사하였다.
ΔΔHAC 태아 #5442A에서 인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현
RT-PCR을 사용하여 ΔΔHAC 태아 #5542A에서 재배열된 인간 중쇄 RNA 전사체의 발현을 검출하였다. 사용한 RT-PCR 프라이머는 CH3-F3
및 CH4-R2 였다. RT-PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, cDNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 하기와 같이 40 주기의 RT-PCR을 실시하였다: 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초.도 15의 레인 4 및 5는 양성 대조군 샘플과 크기가 유사한, 태아 #5442A의 비장으로부터 증폭된 스플라이싱된 뮤 중쇄 불변 영역 서열을 함유하였다. 이러한 결과는 태아 #5442A가 그의 비장에서 재배열된 뮤 중쇄 전사체를 발현시켰음을 가리켰다. RNA 샘플 중에 오염된 게놈 DNA로부터 증폭된 스플라이싱되지 않은 게놈 서열 영역에서도 또한 희미한 밴드가 보였다. 태아 #5442A의 간 및 뇌로부터의 대조군 샘플은 증폭된 재배열된 중쇄 서열에 대해 예상되는 크기의 밴드를 생성하지 않았다.
ΔΔHAC 태아 #5868A에서 인간 중쇄 로커스의 재배열 및 발현
RT-PCR을 사용하여 임신 제 119일의 ΔΔHAC 태아 (태아 #5868A)의 비장에서 재배열된 인간 중쇄 RNA 전사체의 발현을 검출하였다. 이 분석에 사용한 프라이머는 VH30-3
및 CM-1 이었다. 또한, 프라이머 "GAPDH 위" 및 "GAPDH 아래" 를 사용하여 GAPDH 대조군 전사체를 증폭하였다. 이 PCR 분석을 위해, 반응 혼합물을 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 후에, 다수의 주기에 걸쳐 95 ℃에서 1 분, 58 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하여 변성, 어닐링 및 증폭을 실시하였다. 이어서, 혼합물을 72 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.도 16의 레인 3은 상기 ΔΔHAC 태아 #5868A의 분석으로부터 생성된 RT-PCR 생성물을 함유하였다. 이 RT-PCR 생성물은 재배열된 인간 중쇄 (470 염기쌍)의 증폭에 대해 예상된 크기였으며, 재배열된 인간 중쇄 전사체에 상응하는 서열을 함유하는 것으로 공지된 대조군 cDNA와 겔 상에서 동일한 위치로 이동하였다. 대조군으로서, ΔΔHAC 태아 #5868A 태아 비장 cDNA 및 정상 소과 동물 cDNA 샘플 둘 다 GAPDH 프라이머로 증폭시켰을 때 생성물이 생긴 것은 cDNA의 증폭 지지 능력을 입증한 것이다 (레인 7 및 8).
ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B에서 인간 람다 로커스의 재배열 및 발현
인간 람다의 부분을 포함하는 전사체의 증폭에 특이적인 프라이머를 사용하여 재배열된 인간 람다 경쇄 로커스로부터 RNA 전사체를 검출하였다.
도 17에 나타낸 RT-PCR 분석을 위해, 프라이머 Cλ1
, Cλ2-3 , 및 Cλ7 의 등몰 혼합물을 프라이머 Vλ1 LEA1 과 함께 사용하였다. RT-PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10× Ex Taq 완충액 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 정방향 프라이머 10 pmol 및 역방향 프라이머 10 pmol, cDNA 1 ㎕ 및 Ex Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. RT-PCR 조건을 하기와 같았다: 40 주기, 85 ℃에서 3 분, 94 ℃에서 1 분, 98 ℃에서 10 초, 60 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 1 분.도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 RT-PCR 분석도 또한 프라이머 Vλ3LEA1
, Vλ3JLEAD , VλBACK4 의 등몰 혼합물 및 프라이머 Cλ1 , Cλ2-3 및 Cλ7 의 등몰 혼합물을 사용하여 실시하였다. RT-PCR 반응 조건은 도 7에 대해 상기 기재된 바와 동일하였다.도 17의 레인 6 및 7 및 도 18의 레인 4 및 5는 양성 대조군 밴드와 크기가 유사한, 태아 #5442A의 비장으로부터의 RT-PCR 생성물을 함유했는데, 이것은 상기 태아에서 재배열된 경쇄 RNA 전사체의 존재를 가리켰다. 태아 #5442B로부터의 비장 샘플은 매우 약한 (도면에 보이지 않음) 적절한 크기의 밴드를 생성하였다. 이러한 RT-PCR 생성물은 태아 #5442B도 또한 그의 비장에서 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 전사체를 발현시킴을 가리켰다. 예상한 바와 같이, 태아 #5442A 및 5442B의 뇌로부터의 샘플은 재배열된 인간 람다 경쇄 전사체를 발현시키지 않았다.
ΔΔHAC 태아 #5868A에서 인간 람다 로커스의 재배열 및 발현
재배열된 인간 람다 경쇄 로커스로부터의 RNA 전사체도 또한 ΔΔHAC 태아 #5868A에서 검출되었다. 이 분석을 위해, 인간 람다 부분을 포함하는 전사체의 증폭에 특이적인 프라이머를 사용하여 재배열된 인간 람다 로커스의 부분을 코딩하는 전사체의 ΔΔHAC-코딩된 발현을 검출하였다. 프라이머 VL1 LEAI
및 프라이머 CL1 , CL2-3 및 CL7 의 등몰 혼합물을 상기 분석에 사용하였다. 상기 RT-PCR 반응을 위해, 반응 혼합물을 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션한 후에, 다수의 주기에 걸쳐 95 ℃에서 1 분, 60 ℃에서 1 분, 및 72 ℃에서 2 분 동안 인큐베이션하여 변성, 어닐링 및 증폭을 실시하였다. 이어서, 혼합물을 72 ℃에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.이 분석에 의해 ΔΔHAC #5868A (도 19의 레인 4)로부터의 비장 cDNA가 TC 마우스 비장 cDNA 양성 대조군 (레인 6)과 동일한 크기의 RT-PCR 생성물을 생성하였음을 입증하였다. ΔΔHAC #5868A로부터의 뇌 또는 간 cDNA를 사용했을 때는 이러한 RT-PCR 생성물이 검출되지 않았다 (각각 레인 2 및 3). 상기 조직들 각각의 RT-PCR 지지능을 프라이머 "GAPDH 위" 및 "GAPDH 아래"을 사용한 하우스키핑 유전자, GAPDH의 성공적인 증폭에 의해 나타냈다 (레인 8 및 10).
시퀀싱에 의한 ΔΔHAC 재배열의 확인
프라이머 Cλ1, Cλ2-3 및 Cλ7 의 등몰 혼합물과 프라이머 Vλ1LEA1, 또는 프라이머 Vλ3LEA1, Vλ3JLEAD 및 VλBACK4의 등몰 혼합물, 및 프라이머 Cλ1, Cλ2-3 및 Cλ7의 등몰 혼합물을 사용하여 태아 #5442A로부터의 비장 샘플에서 RT-PCR 분석을 실시하였다. CHROMA SPIN 컬럼 (CLONETECH)을 사용하여 PCR 생성물을 정제하고, 사용설명서에 따라 pCR2.1 TA-클로닝 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. Cλ1, Cλ2-3 및 Cλ7 프라이머의 등몰 혼합물을 사용하여 다이 터미네이터 (Dye Terminator) 서열 반응 (ABI Applied System)을 실시하였다. 96 ℃에서 1 분, 96 ℃에서 10 초, 55 ℃에서 5 초 및 60 ℃에서 4 분 동안 25 주기를 실시하였다. 반응 혼합물 10 ㎕는 빅다이 터미네이터 (BigDye Terminator) 반응 혼합물 (3 ㎕), 주형 플라스미드 (200 ng) 및 Cλ1, Cλ2-3 및 Cλ7 프라이머 (1.6 pmol)를 함유하였다. 반응 혼합물을 ABI 3700 시퀀서를 이용하여 분석하였다.
2개 이상의 재배열된 인간 람다 경쇄 전사체를 확인하였다 (V1-17/JL3/Cλ 및 V2-13/JL2/Cλ). 이러한 결과에 의해 인간 람다 경쇄 유전자의 VJ 재배열이 태아 #5442A의 비장내의 ΔΔHAC에서 일어남이 입증되었다 (도 20 및 21).
ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B에서 인간 람다 경쇄 및 소과 동물 중쇄의 발현의 FACS 분석
ΔΔHAC 태아 #5442A 및 5442B로부터의 비장 림프구를 인간 람다 경쇄 및 소과 동물 중쇄 단백질의 발현에 대해 분석하였다. 이 세포들을 4 ℃에서 20 분 동안 피코에리테린 표지된 항-인간 람다 항체 (도 22C 및 22D), FITC 표지된 항-소과 동물 IgM 항체 (도 22D 및 22H)와 반응시키거나, 또는 항체 없이 두었다 (도 22A, 22B, 22E 및 22F). 이어서, 세포를 PBS 및 2％ FCS로 2회 세척하고, FASCalibur 세포 분류기로 분석하였다. 무항체 대조군을 사용하여 항체와 반응한 세포％를 계산하여 전자적으로 게이트를 설정하였다. 이 ％를 각각의 히스토그램 아래에 제시하였다. 태아 # 5442A (도 22A-22D) 및 태아 #5442B (도 22E-22H)는 인간 람다 경쇄 단백질 및 소과 동물 중쇄 단백질을 둘 다 발현하였다.
HAC 송아지에서 인간 항체 단백질의 발현
상기 기재된 바와 같이, 트랜스염색체 (Tc) 송아지를 생산하기 위한 신규 절차를 개발하였다 (도 37). 이 방법은 일차 소과 동물 섬유아세포가 약 35 세대밖에 배가되지 않는 제한된 수명에 기인한 제약 및 공여자 세포에 대형 DNA 삽입물을 도입하고 유지해야 할 필요성을 극복하였다. 특히, 인간 인공 염색체 (HAC) 벡터를 사용하여 소과 동물 일차 섬유아세포에 전체 재배열되지 않은 인간 Ig 중쇄 (IgH) 및 람다 경쇄 (Igλ) 로커스를 둘 다 도입하였다. 선별된 섬유아세포 클론을 회복시키고, 클로닝된 태아를 생산하여 확장시켰다. 클로닝된 태아 세포를 선별하고, 리클로닝하여, 중쇄 및 경쇄 인간 Ig 로커스를 둘 다 기능적으로 재배열하고, 인간 폴리클로날 항체를 생산하는 건강한 Tc 송아지 4 마리를 생산하였다. 이러한 결과는 트랜스제닉 가축의 생산을 위한 HAC 벡터의 사용가능성을 입증한 것이다. 더욱 중요한 것은, 인간 Ig 유전자를 함유하는 Tc 소를 사용하여 항생제 내성 감염의 예방으로부터 바이오테러리즘과의 투쟁에까지 이르는 적용 범위를 갖는 신규 인간 폴리클로날 치료제를 생산할 수 있다는 것이다. 이러한 방법을 이하에 더욱 상세하게 기재하였다.
본원에 기재된 MMCT 기술을 사용하여 CHO 클론으로부터 소과 동물의 태아 섬유아세포에 HAC를 도입하였다. 섬유아세포를 콜로니가 나타나기 시작할 때까지 G418 (700 ㎍/ml)와 함께 HAC 벡터상의 neo 유전자 마커로 선별하였다. 이 단계에서 핵 전달 이전의 세포 분열을 최소화시키기 위해 완전한 항생제 선별 및 DNA-기재 스크리닝은 피하였다. 성장 및 형태를 기준으로 콜로니를 선택하고, 종래에 기재된 바와 같이 핵 전달을 실시하였다 [Lucier et al., J. Immunol 161: 5438-5444, 1998]. 상기 세포들은 며칠 동안만 핵 전달에 유용했기 때문에, 최종 선별은 클로닝된 태아의 생산에 의한 세포의 회복 및 확장 후에 실시하였다.
포배 단계로의 발생은 17 내지 21％의 범위였고, 제40일에 임신은 22 내지 50％의 범위였고, 세포주들 사이에 차이는 없었다. 제56일 내지 제58일에 4개의 ΔHAC 및 2개의 ΔΔHAC 태아를 회수하고, 섬유아세포 세포주를 재생하고, 추가 분석 및 핵 전달을 위해 냉동보존하였다. 제56일 내지 제58일에 수집한 태아 및 제77일 내지 제119일 사이에 수집한 7개의 추가 태아로부터 유도된 섬유아세포주내에서의 HAC의 보유를 G418-내성 (도 38A) 및 IgH 및 Igλ 로커스의 게놈 PCR (도 38B)에 의해 평가하였다. 13개의 태아 중 9개가 G418에 내성을 가졌고, 그 중 8개가 인간 IgH 및 Igλ 로커스 둘 다의 존재를 나타냈다. 제56일 내지 제58일의, 3개의 ΔHAC (#5968, #6032 및 #6045) 및 1개의 ΔΔHAC (#5580) 양성 태아를 사용하여 리클로닝하고, 자손을 생산하였다. 제77일 내지 제119일의 5개의 양성 태아를 RT-PCR 분석한 후에 증폭된 생성물을 시퀀싱하여 인간 Ig 로커스의 발현 및 재배열에 대해 평가하였다. 인간 IgH 및 Igλ 유전자를 모든 태아에서 발현시키고 (도 38C) 적절한 V(D)J 재조합의 증거를 나타냈다 (도 38D).
리클로닝된 ΔHAC 세포주는 37 마리의 수용자 (16％, 도 39A)로부터 한 마리의 수컷 (세포주 #6045로부터의 수컷) 및 5 마리의 암컷 (세포주 #5968 및 #6032로부터의 암컷) 송아지를 생산하였다. 세포주 #6032로부터 유도된 2 마리의 송아지는 생후 48 시간 이내에 사망하였다. 재생되지 않은 ΔΔHAC 세포로부터는 송아지 한 마리가 출생하였다. 생존한 5 마리 송아지 모두 건강하고 표현형이 정상이었다. 모든 송아지에서 G418 선별, 게놈 PCR 및 형광 원위치 혼성화 (fluorescent in situ hybridization, FISH) 분석에 의해 HAC의 보유를 확인하였다 (도 39B 및 39C). FISH 분석 결과에 의하면 HAC는 독립적인 염색체로서 보유되어 있었으며, HAC의 보유 비율은 78 내지 100％였다. 말초 혈액 림프구 (PBL, 91％)와 섬유아세포 (87％) 사이에는 보유율에서 명백한 차이가 관찰되지 않았다. 공여자 세포주 #6045는 공여자 세포주 #5968보다 높은 보유율을 가졌을 수 있었다 (각각 97％ 및 86％). 흥미롭게도, Tc 소과 동물에서의 보유율은 종래에 마우스에서 관찰된 것보다 높을 수 있다. 인간 Ig 로커스가 태아에서 뿐만 아니라 송아지에서도 재배열 및 발현되는지 여부를 결정하기 위해, PBL상에서 RT-PCR 분석을 실시하였다. PBL에서 인간 IgH 및 Igλ 유전자가 둘 다 발현되는지 관찰하고, 서열 분석에 의해 인간 IgH 및 Igλ 레퍼토리의 다양성을 측정하였다 (표 3). 대표적인 서열 세트는 로커스에 걸쳐 분포된 V H /Vλ, D H 및 J H /Jλ 절편의 광범위한 이용을 나타냈다. Igλ 전사체에서, 인간에서의 V H 절편의 사용과 유사한, V H 1 및 V H 3으로부터의 V 절편의 잦은 이용이 관찰되었다. 뉴클레오티드의 결실 뿐만 아니라 비-생식선 뉴클레오티드의 첨가 (N-첨가)도 또한 IgH 및 Igλ 전사체 둘 다에서 관찰되었다. 이것은 중쇄 및 경쇄 둘 다에서 제3 상보성 결정 영역 (CDR3)에서의 고수준의 다양화를 야기하였다. 또한, 고상 ELISA에 의해 측정된 바와 같이, 7 마리 송아지 중 5 마리에서 초유를 수유하기 전에 수집한 혈액 샘플에서 13 내지 258 ng/ml 범위 수준의 인간 Ig 단백질이 검출되었다 (신생 송아지에서는 전형적으로 Ig 발현이 매우 낮아서 검출불가능함). 이러한 데이타는 HAC의 전달이 일차 세포에서 리클로닝 전략을 사용하여 효율적으로 달성될 수 있고 Tc 송아지에서 HAC가 운반하는 인간 Ig 유전자가 적절하게 프로세싱되어 고수준의 다양성으로 발현될 수 있음을 가리킨다.
이러한 연구 결과는 염색체-클로닝, 염색체 전달 및 체세포 세포 리클로닝 기술의 조합을 사용하여 Mb-크기의 게놈 트랜스진을 운반하는 HAC 벡터를 보유하는 건강한 송아지를 생산할 수 있음을 입증한다. 또한, 이러한 기술을 사용하여 소에서 인간 IgH 및 Igλ 유전자 둘 다에 대한 전체 로커스의 전달 및 보유를 입증하였다. 흥미롭게도, 로커스 둘 다 인간 또는 마우스와 실질적으로 상이한 면역생리를 갖는 종에서 적절하게 프로세싱되고 기능적으로 재배열된 인간 이뮤노글로불린 유전자를 발현한다는 것이 입증되었다. 이러한 HAC계는 다양한 복합 인간 단백질 (예를 들어, 헤모글로불린)의 발현 또는 제약 제제를 위한 단백질의 대량 수집에 있어서 유용할 수 있다. 예를 들어, 본 연구에서 생상된, 인간 IgH 및 Igλ 로커스를 둘 다 보유하는 Tc 송아지는 인간 폴리클로날 항체의 생산에 있어서 유용하다. 현재 인간 폴리클로날 항체는 인간 혈액 또는 혈장 공여자로부터만 입수가능하다. 그 결과, 인간 폴리클로날 생성물의 공급 및 적용에는 한계가 있다. Tc 암소를 과면역화시켜 매우 다양한 인간 질병의 치료를 위한 다량의 신규 폴리클로날 치료제를 생산할 수 있다.
실시예 3: 하나 이상의 내인성 항체에서의 돌연변이를 갖는 이종 항체를 생성하는 트랜스제닉 유제동물
이종 항체를 발현시키고 실시예 2에 기재된 프리온 유전자에서 돌연변이를 갖는 유제동물에서, 하나 이상의 내인성 항체 유전자를 돌연변이화시킴으로써 내인성 항체의 발현을 임의로 감소시킬 수 있다. 기능성 이종 이뮤노글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자의 수를 기능성 내인성 중쇄 또는 경쇄 유전자의 수에 비해 증가시킴으로써, 목적 이종 항체 (예를 들어, 인간 치료 항체)를 발현하는 B-세포의 비율을 증가시켜야 한다.
이와 같은 트랜스제닉 유제동물을 생성하기 위해, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 유제동물을 내인성 이뮤노글로불린쇄 (예를 들어, 뮤 중쇄, 또는 람다 또는 카파 경쇄)의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에 돌연변이를 함유하는 트랜스제닉 유제동물과 교배할 수 있다. 필요한 경우, 생성된 트랜스제닉 유제동물을 (i) 내인성 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 프리온 및(또는) J 쇄 핵산의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에 돌연변이를 함유하는 트랜스제닉 유제동물, 또는 (ii) 외인성 J 쇄 핵산 (예를 들어, 인간 J 쇄)를 함유하는 트랜스제닉 유제동물과 교배 할 수 있다. 별법으로, ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 태아로부터의 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)는 하나 이상의 내인성 이뮤노글로불린 유전자의 돌연변이화에 의해 유전공학적으로 변형될 수도 있다. 다른 가능한 방법으로, 내인성 이뮤노글로불린 (뮤 중쇄 및(또는) 람다 경쇄)이 반접합성 또는 동종접합성으로 불활성화된 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)에 ΔHAC 또는 ΔΔHAC를 도입한다. 상기의 어느 방법으로도, 세포는 (i) 돌연변이, 바람직하게는 녹아웃 돌연변이를 내인성 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 프리온 및(또는) J 쇄 핵산의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다에 도입시키거나, 또는 (ii) 외인성 J 쇄 핵산을 도입시킴으로써 유전적으로 변형될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 세포는 이후에 목적 트랜스제닉 유제동물의 생성을 위한 핵 전달 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 방법이 아래에 기재되어 있다.
DNA 구조물
상기 기재된 뮤 중쇄 (도 2A), 람다 경쇄, 카파 경쇄, 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 프리온 및(또는) J 쇄 녹아웃 구조물이 사용될 수 있다. 별법으로, 하기 기재되는 퓨로마이신 내성 뮤 중쇄 구조물이 사용될 수도 있다 (도 3F). 이 녹아웃 구조물은 소과 동물의 뮤 중쇄 로커스 중 4개의 주요 코딩 엑손을 제거하되 막횡단 도메인은 온전하도록 설계되었기 때문에, 뮤 중쇄 로커스가 불활성화된다.
퓨로마이신 내성 구조물은 아래와 같이 조립하였다. 코딩 엑손 1에 매우 근접한 영역을 함유하는 4.4 Kb의 XhoI 단편을 pBluescript II SK+의 XhoI 부위에 삽입하였다. 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 pPGKPuro 플라스미드는 미국 화이트헤드 인스티튜트 (Whitehead Institute)의 피터 더블유. 레어드 (Peter W. Laird) 박사로부터 얻었다. 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하는 1.7 Kb의 XhoI 단편을, 상기 4.4 Kb 단편의 하류에 인접하도록 폴리링커 영역 내에 존재하는 SalI 부위에 서브클로닝하였다. 이러한 1.7 Kb의 퓨로마이신 마커가 소과 동물 이뮤노글로불린 중쇄 로커스의 코딩 엑손 CH1, CH2, CH3 및 CH4를 대체한다. 야생형 게놈 서열에서 상기 4가지 엑손들의 하류에 있는 뮤 로커스의 4.6 Kb 영역을 함유하는 XbaI 단편을, 제2 상동성 영역으로 사용하기 위해 상기 구조물에 부가하였다.
최종 표적화 구조물을 생성하기 위해, 3개의 조립된 단편을 NotI 및 MluI으로 절단하여 이 구조물의 서브클론을 제조하였다. MluI 제한효소 분해는 4.6 Kb 단편을 1.4 Kb로 절단한다. NotI 부위는 폴리링커 내에 존재하며 서브클로닝된 DNA 자체는 NotI 효소로 절단되지 않는다. MluI 부위는 클레나우 (Klenow) 단편으로 채워 블런트 (blunt) 말단을 생성하였으며, NotI/채운 MluI 단편을 pBluescript II SK+ 벡터에 존재하는 NotI 및 SmaI 부위를 이용해 새로운 pBluescript II SK+ 벡터에 서브클로닝하였다. 유전자 표적화를 위해, 최종 벡터를 NotI으로 선형화하였다.
전기천공에 의한 유전자 표적화 및 형질감염된 섬유아세포의 약물 선별
전기천공을 위해, 제한된 횟수의 집단 배가 단계 (doubling)를 거친 1×10 7 개의 소과 동물 태아 섬유아세포 (예를 들어, 실시예 2에 기재된 바과 같이 ΔHAC 또는 ΔΔHAC 트랜스제닉 태아로부터 수득한 섬유아세포)의 단일 세포 현탁액을 1200 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 0.8 ml의 무혈청 알파-MEM 배지에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 0.4 cm의 전기천공용 큐벳 (Invitrogen, 카탈로그 번호: P460-50)에 옮겼다. 이어서, 제한효소에 의해 선형화된 30 ㎍의 유전자 표적화 벡터 DNA를 첨가하고, 큐벳의 내용물을 1 ml 피펫을 이용하여 혼합한 후, 실온에서 2분간의 인큐베이션 단계를 거쳤다. 큐벳을 진 펄서 (Gene Pulser) II 전기천공 시스템 (Biorad)의 충격용 챔버에 삽입한 후, 1000 V 및 50 μF에서 전기천공을 수행하였다. 큐벳을 재빨리 조직 배양 후드로 옮기고, 전기천공된 세포를 약 30 ml의 완전 섬유아세포 배지로 피펫을 통해 옮겼다. 세포를 100 mm 조직 배양 접시 (Corning, 카탈로그 번호: 431079) 30개에 동일하게 분주한 후, 세포가 고루 퍼지도록 가볍게 흔들어 주고 38.5℃/5％ CO 2 에서 16 내지 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 흡인 제거하고, 선택을 위한 선별 약물을 함유하는 완전 섬유아세포 배지로 교체하였다. 배지를 2일마다 교체하면서 총 7일 내지 14일간 계속 인큐베이션하였다. 약물 선별 과정 동안, 대표적인 플레이트를 육안으로 모니터링하여 세포사 및 콜로니 형성을 확인하였다. 음성 대조군 플레이트는 유전자 표적화 벡터가 없는 상태에서 전기천공된 섬유아세포를 함유하도록 하였으며, 약물 선별 과정 동안 콜로니가 형성되지 않도록 하였다.
약물 내성 섬유아세포 콜로니의 채집 및 세포의 증식
약물 선별 단계가 완결된 후 (일반적으로, 7일 내지 14 일), 약물 내성 콜로니를 육안으로 볼 수 있었으며, 증식을 위해 상기 콜로니를 48웰 조직 배양 플레이트에 옮겼다. 이 전달 절차를 보조하기 위해, 조직 배양 플레이트 바닥에 칼라 마커 (Sharpie)를 이용하여 개개의 콜로니를 원형으로 표시하였다. 콜로니를 함유하는 조직 배양 플레이트를 1X D-PBS(Ca 2+ 및 Mg 2+ 무함유)로 2회 세척한 후, 플레이트 당 5 ml의 1:5로 희석된 세포 분리 완충액을 첨가하였다. 실온에서 3 내지 5분간 인큐베이션한 후에 개개의 콜로니가 조직 배양 접시의 바닥으로부터 떨어지기 시작하였다. 콜로니가 떨어지기 전에, P200 피펫맨 및 에어로졸 배리어 피펫 팁 (200 또는 250 ㎕)을 이용하여 이들 각 콜로니를 48웰 조직 배양 플레이트의 웰 1개에 옮겼다. 옮긴 후, 위아래로 피펫팅하여 콜로니를 완전히 분리하고, 1 ml의 완전 섬유아세포 배지를 첨가하였다. 세포의 약물 내성을 보장하기 위해, 약물 선별을 48웰 단계에 걸쳐 계속하였다. 옮긴 콜로니를 38.5℃/5％ CO 2 에서 배양하고, 도립현미경을 통해 시각적으로 모니터링하였다. 2일 내지 7일 후에 전면생장 상태에 근접한 웰들을 1X D-PBS (Ca 2+ 및 Mg 2+ 무함유)로 2회 세척하고, 0.2 ml의 세포 분리 완충액을 첨가한 후, 5분간의 실온 인큐베이션 단계를 거쳐 웰의 바닥에서 떼어냈다. 세포를 떼어낸 후, P1000 피펫맨 및 에어로졸 피펫팁 (1000 ㎕)을 이용하여 위아래로 피펫팅함으로써 세포들을 더 분리하였다. 약 75％의 분리된 섬유아세포를 이후의 PCR 분석을 위한 추가 증식용으로 24웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮겼으며, 나머지 25％의 세포를 증식 및 궁극적으로는 체세포 핵 전달 실험을 위해 사용하도록 제2의 24웰 플레이트의 단일 웰에 옮겼다. 원래 세포들의 75％를 함유하는 플레이트의 세포가 거의 전면생장 상태로 증식했을 때, 유전자 분석을 위해 상기 클론으로부터 DNA를 단리하였다.
DNA 제조
유전자 분석을 위한 DNA 단리에 이용되는 방법은 문헌 [Laird et al., Nucleic Acids Research, 1991, Volume 19, No. 15.]에 기재된 것을 변형하였다. 구체적으로, 특정 클론이 24웰 플레이트의 한 웰에서 거의 전면생장 상태에 도달하면 그 웰에서 배양 배지를 흡인 제거하고 부착 세포를 PBS로 2회 세척하였다. PBS를 흡인 제거하고, 세포를 용해시키며 분리될 DNA로부터의 잉여 단백질을 분해하기 위한 0.2 ml의 완충액으로 교체하였다. 이 완충액은 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.2％ SDS, 200 mM NaCl 및 100 ㎍/ml 프로테이나제 K로 구성되어 있다. 24웰 플레이트를 조직 배양 인큐베이터 안에 다시 넣어 최소 3시간 동안 인큐베이션하여 DNA 방출 및 단백질 분해가 일어나도록 하였다. 이 절차를 거친 점성이 높은 생성물을 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 옮기고, 0.2 ml의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 원심분리에 의해 침전물을 회수하고, DNA 펠릿을 70％ 에탄올로 세정하여 공기 중에서 건조시킨 후, 10 mM Tris (pH 8) 및 1 mM EDTA를 함유하는 완충액 25 내지 50 ㎕에 펠릿을 재현탁하였다. 이 DNA를 클론의 PCR 분석용으로 사용하였다.
클론의 스크리닝
클론을 스크리닝하기 위해 두가지 다른 접근법을 이용하였는데, 이 두가지 방법 모두 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 이용한다. 이 단락에 기재된 모든 접근법은 임의의 다른 유전자를 표적화하는 데 적용될 수 있으며, 단지 유전자 분석에 사용하는 프라이머의 서열이 상이할 뿐이다.
제1 접근법에 따라, 2쌍의 개별 프라이머를 안정적인 형질감염 생성물의 증폭에 각각 사용하였다. 1쌍의 프라이머는 클론의 통합 부위와 무관하게 클론의 게놈에서 표적화 벡터의 존재를 검출하기 위해 사용하였다. 이 프라이머는 둘 다 표적화 벡터에 존재하는 DNA 서열에 어닐링되도록 설계된 것이다. 이 PCR 반응에 따른 PCR 생성물의 강도는 게놈에 통합된 표적화 벡터의 카피수와 상관관계가 있을 수 있다. 따라서, 한 카피수의 표적화 벡터만을 함유하는 세포는 PCR 반응에 따른 밴드의 강도가 더 약하게 되는 경향이 있다. 다른 1쌍의 프라이머는 목적 로커스에 통합된 벡터의 카피만을 검출하기 위해 설계된 것이다. 이 경우, 한 프라이머는 표적화 벡터 내에 어닐링되도록 설계되고, 다른 하나는 표적화될 로커스에 특이적인 서열 (표적화 벡터에는 존재하지 않음)에 어닐링되도록 설계된다. 이 경우, PCR 생성물은 표적화 벡터가 표적화 벡터에 존재하지 않는 부위 바로 다음에 통합된 경우에만을 검출되며, 이는 목적 표적화 현상이 일어났음을 나타낸다. 생성물이 검출된다면, 이 클론을 핵 전달에 사용한다.
네오마이신 내성 중쇄 녹아웃 구조물 제조를 위해, 프라이머 Neo1
및 IN2521 를 통합 위치와 무관하게 세포내 표적화 벡터의 존재 여부를 검출하기 위해 사용하였다. 프라이머 Neo1 및 OUT3570 을, 뮤 중쇄 로커스에 통합된 표적화 구조물의 카피만을 특이적으로 증폭하기 위해 사용하였다.네오마이신 내성 중쇄 녹아웃 구조물의 통합을 분석하기 위한 PCR 반응에는 퀴아젠 (Qiagen) PCR 키트를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 1 pmole의 각 프라이머, 5 ㎕의 10X 반응 완충액, 10 ㎕의 Q 용액, 5 ㎕의 DNA, 및 1 ㎕의 dNTP 용액을 함유하였다. 반응 혼합물은 H 2 O를 사용하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 이 PCR 증폭은 초기 변성 인큐베이션을 94℃에서 2분 동안 수행하였다. 이어서, 변성, 어닐링 및 증폭을 30 사이클 수행하되, 각각 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, PCR 기계에서 꺼낼 때까지 4℃에서 보관하였다.
다른 접근법으로, 단일 프라이머 세트를 사용하여 표적화 로커스를 증폭하였으며, PCR 생성물의 크기를 기준으로 올바른 표적화 여부를 판단하였다. 한 프라이머는 표적화 벡터에 없는 로커스의 영역에 어닐링되도록 설계되었고, 다른 프라이머는 표적화 벡터에 존재할 뿐만 아니라 야생형 로커스에도 존재하는 부위에 어닐링되도록 설계되었다. 이 경우, 게놈의 원하지 않는 부위에 통합된 표적화 벡터는 검출되지 않는다. 표적화 벡터에 의해 결실되는 영역이 그 위치에 삽입된 약물 선별 마커와 크기가 다르기 때문에, 생성물의 크기는 증폭된 로커스가 야생 유전자형인지 표적화된 유전자형인지에 따라 달라진다. 표적화 벡터에 삽입이 발생하지 않았거나 부적절하게 삽입된 클론으로부터의 DNA 증폭은, 야생형 로커스에 대해 예상되는 크기의 PCR 생성물이 하나만 생성되도록 한다. 올바르게 표적화된 ("녹아웃") 대립유전자를 함유하는 클론으로부터의 DNA 증폭은 2개의 PCR 생성물이 만들어지도록 하는데, 이 중 하나는 야생형 대립유전자의 증폭을 나타내며, 다른 하나는 야생형 대립유전자의 일부 서열이 약물 내성 마커로 치환 (치환 대상 서열과 길이가 상이함)되었기 때문에 변형된 예측가능한 크기의 것이다.
퓨로마이신 내성 중쇄 녹아웃 구조물의 경우, 프라이머 Shortend
및 Longend 를 사용하였다. 이들 프라이머 쌍은 야생형 중쇄 로커스, 및 퓨로마이신 구조물에 의해 적절하게 표적화된 로커스 둘 다를 증폭시킨다. 두 밴드의 크기 차이는 약 0.7 Kb이다. 짧은 밴드의 존재는 적절한 표적화를 나타낸다.퓨로마이신 내성 중쇄 녹아웃 구조물의 통합을 분석하기 위한 PCR 반응의 경우, 프로메가 마스터 믹스 키트 (Promega Master Mix kit)를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 1 pmole의 각 프라이머, 2.5 ㎕의 DNA, 및 25 ㎕의 2X 프로메가 마스터 믹스를 함유하였다. 반응 혼합물은 H 2 O를 사용하여 총 부피가 50 ㎕가 되도록 하였다. 이 PCR 증폭은 초기 변성 인큐베이션을 94℃에서 2분 동안 수행하였다. 이어서, 변성, 어닐링 및 증폭을 30 사이클 수행하되, 각각 94℃에서 45초, 60℃에서 45초, 및 72℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, PCR 기계에서 꺼낼 때까지 4℃에서 보관하였다.
제1 라운드의 핵 전달
이뮤노글로불린 유전자가 불활성화된 선별된 섬유아세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 핵 전달용으로 사용하여, 내인성 이뮤노글로불린 유전자에 돌연변이가 있고 이종 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하는 HAC를 함유하는 트랜스제닉 유제동물을 생성할 수 있다. 별법으로, 표준 방법을 이용하여 핵 전달을 수행함으로써, 선별된 트랜스제닉 섬유아세포로부터의 핵 또는 염색질 덩어리 (즉, 막에 의해 둘러싸이지 않은 하나 이상의 염색체)를 핵을 제거한 난모세포 (예를 들어, USSN 60,258,151 (2000년 12월 22일 출원)에 기재되어 있음)에 삽입할 수 있다. 이러한 방법은 내인성 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제, 프리온 및(또는) J 쇄 핵산이 돌연변이된 세포에 사용될 수도 있다.
제2 라운드의 돌연변이유발 및 핵 전달
필요한 경우, 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포)를 제1 라운드의 핵 전달로부터 생성된 트랜스제닉 유제동물에서 얻을 수 있다. 추가 라운드의 유전자 표적화를 상기 기재된 바와 같이 수행하여, 제1 라운드의 표적화에서 불활성화된 유전자의 제2 대립유전자를 불활성화할 수 있다. 별법으로, 다른 이뮤노글로불린 (예를 들어, 뮤 중쇄, 람다 경쇄, 카파 경쇄, 또는 J 쇄), 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 또는 프리온 유전자를 이번 라운드의 표적화에서 불활성화할 수 있다. 제2 라운드의 표적화의 경우, 보다 높은 농도의 항생제가 사용되거나 또는 다른 항생제 내성 마커를 갖는 녹아웃 구조물이 사용될 수 있다. 항생제 내성 세포들은 상기 기재된 바와 같이 선별할 수 있다. 선별된 세포들은 상기 기재된 바와 같은 제2 라운드의 핵 전달에 사용되어, 예를 들어 내인성 이뮤노글로불린 유전자에 2개의 돌연변이를 함유하며 이종 이뮤노글로불린 유전자를 코딩하는 HAC를 함유하는 트랜스제닉 유제동물을 생성할 수 있다. 별법으로, 선별된 항생제 내성 세포를 우선 하기 기재되는 바와 같이 처리하여 G1기 세포를 단리하고, 이를 제2 라운드의 핵 전달에 사용할 수 있다.
핵 전달용 G1기 세포의 단리를 위해, 단리 24 시간 전에 5.0×10 5 개의 세포를 10 ml의 α-MEM + FCS가 함유된 100 mm 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 다음 날, 단리하기 전에 플레이트를 PBS로 세척하고 배양 배지를 1 내지 2 시간 동안 교체하였다. 이어서, 플레이트를 볼텍스-제니 2 (Fisher Scientific, Houston, TX, 중간 속도)에서 30 내지 60초 동안 진탕하고, 배지를 제거하고, 1000 G에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 250 ㎕의 MEM + FCS에 재현탁하였다. 이어서, 세포질 브릿지에 의해 부착된, 새로이 분열된 세포 쌍 (이들은 초기 G1기의 세포임)을 선별하였다. 이 단리 절차는 "진탕 분리" 방법이라 언급된다.
실시예 4: 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 돌연변이시키는 추가의 방법
본 접근법의 몇몇 실시양태에서, 프리온 유전자에 하나 이상의 돌연변이가 존재하는 유제동물에서의 이종 이뮤노글로불린의 생성은 본질적으로 상동성 재조합 기술, 전체 이종 Ig 로커스를 보유한 인공 염색체의 도입, 핵 전달, 및 내인성 항체를 제거하기 위한 항체의 투여를 병용함으로써 달성된다. 보다 구체적으로, 이 방법은 바람직하게는 IgM 중쇄 유전자 중 하나 또는 두 대립유전자의 표적화된 붕괴, 및 임의로는 Ig 경쇄 유전자의 하나 또는 두 대립유전자의 표적화된 붕괴를 포함하지만, 이종 항체의 제조는 Ig 핵산에 돌연변이가 없는 동물에서 달성될 수 있다. 유전자 녹아웃은 순차적인 상동성 재조합 이후의 다른 교배 절차에 의해 달성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 이는 우선 조직 배양액 중의 수컷 또는 암컷 유제동물 (예를 들어, 소과 동물) 태아 섬유아세포의 IgM 중쇄 유전자 중 하나의 대립유전자를 적합한 상동성 재조합 벡터를 사용하여 표적화 붕괴시킴으로써 달성된다. 태아 섬유아세포를 사용하는 것은 몇몇 다른 체세포를 사용하는 것보다 바람직한데, 이는 이들 세포가 조직 배양액에서 용이하게 증식하고 용이하게 유전자 조작될 수 있기 때문이다. 그러나, 태아 섬유아세포를 사용하는 것이 본 발명에서 필수적인 것은 아니며, 실제로 다른 세포주들로 대체하여도 동등한 결과를 나타낼 수 있다.
물론, 이 방법은 유제동물 게놈의 IgM 중쇄 대립유전자로의 통합시 표적화된 IgM 중쇄 대립유전자에 대해 상동성인 영역을 갖는 DNA 구조물이 그 발현을 중단시키도록 하는 상기 DNA 구조물의 제조를 수반한다. IgM 대립유전자의 그러한 표적화 붕괴를 수행하기 위한 예시적인 벡터가 하기 실시예에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 표적화된 부위에서 상동성 재조합을 제공하는 벡터의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 더욱이, 본 발명의 경우, 다른 유제동물로부터의 이뮤노글로불린 유전자 서열과 같이, 특히 소과 동물 IgM 중쇄 및 Ig 람다 경쇄 유전자의 서열이 공지되어 있음을 고려할 때, 적합한 벡터의 제조는 당업자의 기술 수준 범위 내에 있다 (하기 참조). 상동성 재조합을 용이하게 하기 위해, IgM 유전자의 상동성 재조합 및 불활성화를 각각 달성하기 위해 사용된 벡터는 유제동물 IgM 중쇄 및 Ig 경쇄 유전자와 실질적인 서열 동일성을 나타내는 DNA 부분을 포함한다. 바람직하게는, 상동성 재조합 및 표적화된 결실 또는 불활성화를 용이하게 하기 위해 이들 서열은 표적화된 유전자 로커스와 98％ 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 99％ 이상의 서열 동일성을 가지며, 보다 더 바람직하게는 동계유전자이다.
통상적이고 바람직하게는, 구조물은 목적 상동성 재조합체, 예를 들어 IgM 중쇄 유전자 및(또는) Ig 경쇄 유전자가 효과적으로 붕괴된 섬유아세포의 선별을 제공하는 마커 유전자를 포함할 것이다. 예시적인 마커 유전자로는 특히 항생제 내성 마커, 약물 내성 마커 및 녹색 형광 단백질이 있다. 바람직한 구조물은 도 2A에 도시되어 있으며, 이 구조물을 제조하기 위해 사용된 출발 물질은 도 3A 및 3B에 도시되어 있다. 프로모터에 작동가능하게 연결된 양성 선별 마커 (예를 들어, 항생제 내성 유전자)와 인접한 내인성 이뮤노글로불린 유전자에 상동성이 있는 2개의 영역을 함유하는 다른 구조물을, 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 이를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다.
도 2A 및 3C에 도시한 뮤 녹아웃 구조물은, "C-뮤 엑손 1-4"로 명명된 소과 동물의 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역을 코딩하는 엑손 및 "TM 엑손"으로 명명된 막횡단 도메인을 코딩하는 2개의 엑손을 제거하도록 설계되었다.
이 벡터를 제조하기 위해, 소과 동물 게놈의 뮤 중쇄 서열에서 유래한 XbaI-XhoI 단편 영역 ("1"로 명명됨)을, 미리 제한효소 XbaI 및 XhoI으로 절단한 시판용 DNA 벡터 pBluescript (Stratagene, LaJolla, California)에 서브클로닝하였다. 일단 이 단편이 클로닝되면, XbaI 부위에 인접하여 NotI 제한효소 인식 서열이 존재하기 때문에, 이를 이용하여 약 3.5 Kb의 NotI 단편을 삽입하였다. 이 단편은 하기에 추가로 기재되는 네오마이신 내성 마커를 함유한다. 필요한 경우, 다른 유제동물 품종, 종 또는 속에서 유래한 게놈 뮤 중쇄 서열 (예를 들어, 스위스 황소/홀스타인 잡종 유래의 진뱅크 (Genebank) 허가번호 U63637로 기탁된 뮤 중쇄 서열)을 사용하여 다른 뮤 녹아웃 구조물을 제조할 수 있다.
단편 "1" 및 네오마이신 내성 마커가 pBluescipt 중에 함께 연결되면, 네오마이신 내성 마커에 인접하여 SacI 부위가 남게 된다. SacI으로 신규 구조물을 선형화시키고, SacI 분해로 생긴 접착성 말단을 DNA 중합효소로 채워 블런트 말단으로 전환시켰다.
"2"로 명명된 단편을 XhoI-BstI1071 단편으로서 단리하고, XhoI 및 BstI1071 효소 분해로 생긴 접착성 말단을 DNA 중합효소로 채워 블런트 말단 단편으로 전환시켰다.
상기 과정이 완료된 후, 최종 구조물은 각각 영역 2, 네오마이신 내성 마커 및 영역 1을 함유하였다.
소과 동물 섬유아세포의 형질감염을 위해, 구조물을 제한효소 KpnI (개략도에 2개의 KpnI 부위가 나타남)으로 분해하고, 이 DNA 단편을 사용하여 상동성 재조합을 수행하였다.
네오마이신 내성 구조물을 다음과 같이 조립하였다. "pSTneoB"로 명명된 구조물 (Katoh et al., Cell Struct. Funct. 12:575, 1987; 재패니스 콜렉션 오브 리서치 바이올로지컬스 (Janpanese Collection of Research Biologicals; JCRB) 기탁번호: VE039)이, 코딩 영역의 상류에 있는 SV40 프로모터 및 TK 인핸서의 조절을 받는 네오마이신 내성 유전자를 함유하도록 설계하였다. 코딩 영역의 하류는 SV40 종결 서열이다. neo 카세트는 "pSTneoB"로부터 XhoI 단편으로서 절단하였다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 단편의 말단을 블런트 말단으로 전환시킨 후, 블런트 말단의 단편을 벡터 pBS246 (Gibco/Life Technologies)의 EcoRV 부위에 클로닝하였다. 이 부위는 loxP 부위에 인접해 있다. "pLoxP-STNeoR"로 명명된 신규 구조물을 사용하여 뮤 녹아웃 DNA 구조물을 제조하였다. 이 구조물의 목적 단편은, 원래 pBS246 클로닝 벡터 내에 존재했던 loxP 부위 및 NotI 부위와 인접해 있다. loxP-neo-loxP를 함유하는 목적 NotI 단편을 이뮤노글로불린 뮤 불변 영역 엑손의 치환용으로 사용하였다. 네오마이신 내성 유전자에 작동가능하게 연결된 SV40 프로모터는 네오마이신 내성 유전자의 전사를 활성화시킴으로써, 목적 NotI 단편으로 뮤 불변 영역 엑손이 치환된 세포를 생성된 항생제 내성에 기초하여 선별할 수 있도록 한다.
IgM 중쇄 대립유전자가 효과적으로 붕괴된 세포주를 얻은 후, 이를 핵 전달 공여자로 사용하여 클로닝된 유제동물 태아 (예를 들어, 클로닝된 소과 동물 태아)를 제조하고, 최종적으로 IgM 중쇄 대립유전자 중 하나가 붕괴된 태아 또는 동물을 제조한다. 그 후, 이들로부터 유도된 체세포 (예를 들어, 섬유아세포)를 사용하여 제2 라운드의 유전자 표적화 붕괴를 수행함으로써, 제2의 IgM 중쇄 대립유전자가 불활성화된 세포를 유사한 벡터이지만 상이한 선별 마커를 함유하는 벡터를 사용하여 제조할 수 있다.
바람직하게는, 제1 표적화 유전자 붕괴에 수반하여, 제2 유제동물 (예를 들어, 소과 동물) 체세포주가 또한 유전공학적으로 변형되는데, 상기 세포주는 유사하게 수컷 또는 암컷 기원일 수 있다. 조작된 제1 세포주가 수컷이라면, 암컷 세포주를 변형시키는 것이 바람직하다. 반대로, 조작된 제1 세포주가 암컷이라면, 수컷 세포주를 선택하는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는, 조작된 세포는 유제동물 (예를 들어, 소과 동물) 태아 섬유아세포를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, Ig 람다 경쇄 유전자의 한 대립유전자의 표적화된 붕괴을 도입하기 위해 암컷 태아 섬유아세포가 유전공학적으로 변형된다. 이 방법은 유사하게 유제동물 (예를 들어, 소과 동물) Ig 람다 경쇄에 상동성이 있는 영역을 갖는 벡터, 및 선별 마커를 사용하여 수행되고, 이 DNA 구조물은 통합 및 내인성 Ig 경쇄와의 상동성 재조합시에 표적화된 Ig 람다 경쇄 유전자의 붕괴 (불활성화)가 발생하도록 설계되어 있다.
목적 표적화 붕괴가 발생한 암컷 섬유아세포 세포주가 선별되면, 이 세포주를 핵 전달용 공여자 세포로 유사하게 사용하거나, 또는 이러한 세포주로부터의 DNA를 핵 전달용 공여자로서 사용한다.
별법으로 이 세포는, 제1 대립유전자를 붕괴시키기 위해 사용된 것과 유사하지만 상이한 선별 마커를 함유하는 DNA 구조물을 사용하여, 제2 Ig 람다 경쇄를 불활성화하기 위한 제2 라운드의 상동성 재조합에 적용될 수 있다.
핵 전달을 수행하는 방법, 및 특히 클로닝된 소과 동물 및 클로닝된 트랜스제닉 소과 동물의 제조 방법은 보고되어 있으며, 미국 특허 제5,945,577호에 기재되어 있다. 별법으로, PCT 공개번호 WO 95/16670호, WO 96/07732호, WO 97/07669호 또는 WO 97/07668호 중 어느 하나에 개시된 핵 전달 기술 (로슬린 (Roslin) 방법으로 통칭함)이 이용될 수도 있다. 로슬린 방법은 증식하는 공여자 세포보다는 정지 세포를 사용한다는 점에서 매사추세츠 대학의 기술과는 상이하다. 이들 특허 모두는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된다. 이들 핵 전달 절차는 클로닝된 트랜스제닉 소과 동물 자손 (예를 들어, Ig 경쇄 유전자 및(또는) IgM 유전자의 대립유전자 중 하나 이상이 표적화 붕괴를 포함하는 자손)을 생성하는 데 사용될 수 있는 클로닝된 트랜스제닉 태아를 생성할 것이다. 이러한 세포주가 생성된 후, 이들은 수컷 및 암컷의 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃 (M 및 F 헤미 H/L) 태아 및 자손을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 이들 기술은 트랜스제닉 소과 동물의 생성을 위해서만 사용되지는 않으며, 상기 기술들은 다른 유제동물의 핵 전달을 위해서도 사용될 수 있다.
핵 전달 후, 목적 동물의 생성은 유제동물의 교배에 의해 또는 상기 기재된 상동성 표적화 벡터를 사용한 제2 유전자 표적화에 의해 영향을 받을 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 추가의 목적은 수컷 및 암컷의 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃의 생성을 포함하고, 여기서 상기 반접합성 녹아웃은 상기 기재된 세포주를 사용하여 제조된다. 이는 상기 기재된 방법에 따라 제조된 자손의 교배에 의해 영향을 받을 수 있고, 여기서 IgM 중쇄 유전자의 붕괴된 대립유전자를 포함하는 자손은 Ig 경쇄의 붕괴된 대립유전자를 포함하는 다른 자손과 교배된다. 별법으로, 이는 상기 기재된 절차에 따라 제조된 자손으로부터 수득된 세포를 조작함으로써 제2 유전자 표적화에 의해 영향을 받을 수 있다. 이는 IgM 중쇄 유전자의 대립유전자 또는 Ig 경쇄의 대립유전자의 상동성 재조합으로 표적화된 붕괴에 의한 수행을 포함할 것이다. 수컷 및 암컷의 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃 (M 및 F 헤미 H/L)을 포함하는 세포주가 생성된 후, 이를 사용하여 상기 녹아웃을 포함하는 태아 또는 송아지를 생성할 것이다. 언급한 바와 같이, 이는 교배에 의해 또는 제2 유전자 표적화에 의해 수행된다.
수컷 및 암컷의 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃이 수득되면, 이들 동물로부터의 세포를 사용하여 동종접합성 녹아웃 (호모 H/L) 태아를 생성할 수 있다. 마찬가지로, 이는 순차적인 유전자 표적화 또는 교배에 의해 영향을 받을 수 있다. 본질적으로, 교배에 의해 영향을 받는 경우, 이는 수컷 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃을 암컷 중쇄 및 경쇄 반접합성 녹아웃과 교배시키고, 동종접합성 녹아웃을 포함하는 자손을 선별하는 것을 포함할 것이다. 별법으로, 상기 기재된 반접합성 녹아웃으로부터의 세포를 조직 배양액 중에서 조작함으로써, IgM 또는 Ig 경쇄 (람다) 유전자의 다른 대립유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 제2 유전자 표적화는 교배에 비해 바람직할 수 있는데, 이는 제2 유전자 표적화가 (특히, 소과 동물과 같은 유제동물의 임신 기간이 비교적 장기간임을 고려할 경우) 보다 신속한 결과를 제공하기 때문이다.
이 순차적인 녹아웃 및(또는) 교배 전략 수행 중에, 프리온 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 다가 상기 과정 동안 생성된 임의의 공여자 세포 (예를 들어, 내인성 Ig 핵산에 돌연변이가 존재 또는 부재하고, 이종 Ig 핵산이 존재 또는 부재하는 공여자 세포)에서 돌연변이화될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 이용하여 생성된 유제동물은 프리온 유전자, Ig 중쇄 유전자, Ig 경쇄 유전자, 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 및(또는) J 쇄 유전자에서 임의의 수의 목적 돌연변이를 가질 수도, 1종 이상의 이종 Ig 및(또는) J 쇄 유전자를 가질 수도 있다.
인간 Ig를 발현하는 트랜스제닉 유제동물을 생성하기 위한 녹아웃 절차
호모 H/L 태아 또는 송아지의 생성에 관한 접근법은 도 1에 요약되어 있다. 도 1에는 3가지 설계가 약술되어 있다. 제1 설계는 재생된 태아 세포주에서의 연속적인 녹아웃에 의존한다. 이 접근법은 기술적으로 가장 어렵고 가장 위험 수준이 높지만, 상기 언급한 바와 같이 잠재적으로 교배 접근법보다는 신속한 결과를 산출한다. 다른 두가지 설계는 동물 교배에 의존한다. 제2 설계에서, 중쇄 및 경쇄 유전자의 단일 녹아웃만이 각각 수컷 및 암컷 세포주에서 요구된다. 이 설계는 세포주의 재생에 의존하지 않고 기술적으로 가장 간단한 접근법이지만, 완성하는 데 가장 오랜 시간이 소요된다. 제3 설계는 제1 및 제2 설계 사이의 중간에 해당하는 것이다. 모든 설계에서 호모 H/L 태아만이 생성되는데, 이는 호모 H/L 녹아웃 송아지의 생존 및 유지가 잠재적으로 어렵기 때문이다. 필요한 경우, 수동 면역요법을 이용하여 호모 H/L 녹아웃 송아지의 생존율을 높일 수 있다.
실험 설계
바람직하게는, 본 발명은 반접합성 수컷 중쇄 녹아웃 (M 헤미 H) 및 반접합성 암컷 경쇄 녹아웃 (F 헤미 L)의 생성, 및 이들 표적화된 결실 유래의 40일된 태아의 생성을 포함한다. 배아로부터의 세포를 수집하고, 경쇄 로커스의 대립유전자 중 하나를 M 헤미 H 세포에 표적화시키고 중쇄 로커스의 대립유전자 중 하나를 F 헤미 L 세포에 표적화시킴으로써, H 및 L 로커스 둘 다에 반접합성 결실이 있는 세포를 생성한다 (헤미 H/L). 이들 세포를 사용하여 40일된 태아를 유도하고, 여기서 섬유아세포를 단리한다.
M 헤미 H/L 섬유아세포를 다른 H쇄 대립유전자로 표적화시켜 M 호모 H/헤미 L을 생성하고, F 헤미 H/L을 다른 L쇄 대립유전자로 표적화시켜 F 호모 L/헤미 H를 생성한다. 동종접합성 결실을 생성하기 위해, 높은 농도의 약물을 사용하여 동종접합성 표적화를 유도한다. 그러나, 이 접근법은 성공적이지 못할 수 있으며, 반드시 교배가 필요할 수도 있다. 선별 카세트의 cre/lox 표적화에 의존하는 예시적인 방법은 하나 초과의 표적화된 결실에 대해 동일한 선별 시스템이 이용될 수 있도록 한다. 이들 섬유아세포를 클로닝하고, 40일된 태아를 수집하고, 섬유아세포를 단리한다. 이 클로닝으로부터의 태아 세포를 표적화시켜 H 또는 L 로커스의 동종접합성 결실을 생성함으로써, M 호모 H/L 및 F 호모 H/L 태아 섬유아세포를 수득한다. 이들 섬유아세포를 클로닝하여 40일된 태아를 유도하고 섬유아세포를 단리한다. 이어서, 호모 H/L 태아 섬유아세포를 사용하여, 임의로 육종 절차를 이용함으로써 HAC를 혼입시킨다.
라이브러리 제조
태아 섬유아세포를 사용하여 게놈 라이브러리를 제조한다. 표적화 구조물이 클로닝에 사용되는 세포와 동계유전자일 것이 중요하다고 보고되었지만, 이것이 본 발명에서 필수적인 것은 아니다. 예를 들어, 내인성 이뮤노글로불린 유전자에 돌연변이를 생성하기 위해, 동계유전자, 실질적인 동계유전자 또는 비-동계유전자 구조물이 사용될 수 있다. 한 가지 가능한 방법에서, 유전적으로 다른 소 품종에 비해 높은 수준의 순계교배성(inbreeding)을 갖는 홀스타인 소가 사용된다. 본 발명자들은 상이한 동물들 사이에서 이뮤노글로불린 유전자의 어떠한 다형성도 검출하지 못했다. 이는 서열 상동성이 높아야 하고, 비-동계유전자 구조물을 사용한 표적화가 성공적이어야 한다는 것을 시사한다.
"클로닝 가능성" 시험 수행과 동시에 하나의 수컷 세포주 및 하나의 암컷 세포주로부터 라이브러리가 제조된다. 공정의 마지막에, 라이브러리가 생성되고, 다수의 상이한 태아 세포주가 시험되어 하나의 세포주가 클로닝 목적을 위해 최적인 것으로 선택될 것이라고 예상된다. 태아 섬유아세포로부터 단리된 고분자량 DNA를 사용하여 게놈 라이브러리를 제조한다. DNA를 크기별로 분리하고, 20 내지 23 Kb 사이의 고분자량 DNA를 람다 파지 벡터인 람다잽 (LambdaZap) 또는 람다픽스 (LambdaFix)에 삽입한다. 본 발명자들은 스트라타진 (Stratagene)에서 제조한 라이브러리를 사용하여 훌륭하게 성공하였다. 따라서, DNA를 단리하고, 크기를 기준으로 선별된 DNA를 스트라타진사로 보내 라이브러리를 제조하였다. 소과 동물 중쇄 및 경쇄를 함유하는 클론을 단리하기 위해, 방사성표지된 IgM cDNA 및 방사성표지된 경쇄 cDNA를 사용한다. 또한, 경쇄 게놈 클론을 단리하고, 필요한 경우 경쇄 로커스를 결실시킨다. 클론을 함유하는 소과 동물 중쇄 및 경쇄에 대해 각각의 태아 세포 라이브러리를 스크리닝한다. 약 10 5 내지 10 6 개의 플라크를 스크리닝해야 중쇄 또는 경쇄 로커스를 함유하는 클론을 단리할 수 있을 것으로 예상된다. 일단 단리되면, 두가지 로커스를 pBluescript에 서브클로닝하고, 제한효소 지도를 작성한다. 홀스타인에서의 이들 로커스의 제한효소 지도를 도 2B에 제공한다 [Knight et al., J Immunol 140(10):3654-9, 1988]. 또한, 수득된 클론으로부터의 지도를 작성하여 표적 구조물의 조립에 사용한다.
표적화 구조물의 제조
중쇄 및 경쇄 유전자가 단리되면 구조물을 제조한다. IgM 구조물은 IgM 불변 영역 막 도메인을 결실시킴으로써 제조한다. 라예스키 (Rajewsky) 및 그 동료들이 마우스에서 입증했던 바와 같이, IgM의 막 도메인 결실은 B-세포 발생을 차단하는데, 이는 표면 IgM이 지속적인 B-세포 발생에 요구되는 신호이기 때문이다 [Kitamura et al., Nature 350:423-6]. 따라서, 동종접합성 IgM 소는 B-세포가 결여되어 있다. 이는 본 발명의 전략에서 기능적 Ig가 결여된 동물이 반드시 생존해야할 필요는 없기 때문에 문제가 되지는 않는다. 그러나, 필요한 경우에는 인간 Ig 로커스가 도입될 때 마지막 단계까지 동물이 생존하도록 향상시키기 위해 수동 면역요법을 이용할 수도 있다.
IgM 중쇄 대립유전자의 녹아웃을 수행하기 위해 사용된 표적화 구조물의 예가 도 2A에 도시되어 있다. 중쇄의 경우, 막 IgM 도메인은 lox P 부위가 인접하고 있는 네오마이신 카세트로 치환된다. 부착된 막 도메인은 neo 카세트와 함께 스플라이싱되어 상기 막 도메인이 lox P 부위의 5'에 가장 근접하여 삽입된 TAG 종결 코돈을 갖게 됨으로써, 막 도메인이 확실하게 불활성화된다. 이는 약 5 내지 6 kb의 3' 염색체 DNA를 보유한 표적 구조물의 5'에 위치한다.
약물 농도의 증가가 IgM 중쇄 또는 경쇄 중 어느 하나의 제2 대립유전자를 결실시키지 못한다면, 선별 마커를 결실시키기 위해 cre/lox 시스템 (문헌 [Sauer, 1998, Methods 14: 381-392]에서 고찰됨)을 이용한다. 하기 기재되는 바와 같이, cre/lox 시스템은 선별 마커의 표적화된 결실을 가능하게 한다. 필요한 경우, 모든 선별 마커가 loxP 서열에 인접하여 이들 마커의 결실을 용이하게 한다.
경쇄 구조물은 소과 동물 람다 쇄 불변 영역 (예를 들어, 진뱅크 허가번호 AF396698에서 발견되는 람다 경쇄 불변 영역, 또는 임의의 다른 유제동물의 람다 경쇄 불변 영역), 및 lox P 부위에 인접한 퓨로마이신 내성 유전자 카세트를 함유하고, 소과 동물 유전자를 lox P 부위에 인접한 퓨로마이신 카세트로 치환할 것이다. 람다 불변 영역 유전자의 3'에 있는 약 5 내지 6 kb의 DNA는 퓨로마이신 내성 유전자의 3'으로 치환될 것이다. 퓨로마이신 내성 유전자는 5' 및 3' 말단에 lox P 부위를 보유할 것이며, 필요한 경우 lox P 부위로 인해 결실이 발생할 수 있다. 유제동물 항체 유전자들 사이의 높은 상동성으로 인해, 진뱅크 허가번호 AF396698의 소과 동물 람다 경쇄 서열이 다양한 유제동물의 게놈에 존재하는 람다 경쇄 서열과 혼성화될 것으로 예상되고, 따라서 이를 표준 방법에서 이용하여 다양한 유제동물의 람다 경쇄 게놈 서열을 단리할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 표준 방법에 이들 게놈 서열을 사용하여, 임의의 유제동물에서 내인성 람다 경쇄를 불활성화하기 위한 녹아웃 구조물을 제조할 수 있다.
카파 경쇄 녹아웃 구조물은, 도 3G의 소과 동물 카파 경쇄 서열 또는 임의의 다른 유제동물 카파 경쇄 서열을 사용하여 유사하게 제조할 수 있다. 이 소과 동물 카파 경쇄는 다양한 유제동물로부터 게놈 카파 경쇄 서열을 단리하기 위한 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 표준 방법에서 이들 게놈 서열을 사용하여, 임의의 유제동물에서 내인성 카파 경쇄를 불활성화하기 위한 녹아웃 구조물을 제조할 수 있다.
부가적인 유제동물 유전자가 임의로 돌연변이되거나 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 인간에게 투여되는 본 발명의 항체 중 유제동물 Ig J 쇄의 잠재적인 항원성을 방지하기 위해, 유제동물의 내인성 Ig J 쇄 유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 표적화 벡터의 제조를 위해, 진뱅크 허가번호 U02301에서 발견되는 소과 동물 Ig J 쇄의 cDNA 서열을 사용할 수 있다. 이 cDNA 서열은 RPC1-42 (BACPAC; Oakland, CA)와 같은 BAC 라이브러리로부터 소과 동물 Ig J 쇄의 게놈 서열을 단리하거나, 또는 임의의 다른 유제동물로부터 J 쇄의 게놈 서열을 단리하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 또한, 인간 IgA 및 IgM 분자의 기능적 발현을 위해, 인간 J 쇄 코딩 서열을 본 발명의 유제동물에 도입할 수 있다. 인간 J 쇄의 cDNA 서열은 진뱅크 허가번호 AH002836, M12759 및 M12378로부터 입수할 수 있다. 이 서열은 본원에 기재된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 유제동물 태아 섬유아세포로 삽입될 수 있다. 예를 들어, HAC, YAC 벡터, BAC 벡터, 코스미드 벡터, 또는 녹인 구조물 내의 인간 J 쇄 핵산이 내인성 유제동물 염색체로 통합되거나 또는 내인성 유제동물 염색체와는 독립적으로 유지될 수 있다. 생성된 트랜스제닉 유제동물 세포를 본원에 기재된 핵 전달 방법에 사용하여, 기능적 유제동물 J 쇄의 발현을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 가지며, 인간 J 쇄를 발현하는 이종 핵산을 함유하는 바람직한 유제동물을 생성할 수 있다.
또한, 유제동물의 α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자를 돌연변이시켜, α-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 효소에 의해 생성되는 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프의 발현을 감소시키거나 제거할 수 있다. 본 발명의 유제동물에 의해 생성된 인간 항체가 상기 탄수화물 에피토프에 의해 변형된다면, 이들 글리코실화된 항체는 인간에게 치료제로서 투여되는 경우에 상기 탄수화물 에피토프와 반응성인 수용자의 항체에 의해 불활성화되거나 제거될 수 있다. 상기 탄수화물 에피토프에 대한 상기 가능한 면역 반응을 제거하기 위해, 소과 동물 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 서열을 사용하여, 유제 동물에서 이 유전자를 불활성화하기 위한 녹아웃 구조물을 설계할 수 있다 [진뱅크 허가번호 J04989; Joziasse et al., J. Biol. Chem. 264(24):14290-7, 1989]. 미국 특허 제6,153,428호 및 제5,821,117호에 개시되어 있는 소과 동물 서열 또는 돼지과 동물 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 서열을 사용하여, 다양한 유제동물로부터 게놈 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 서열을 수득함으로써, 갈락토실(α1,3)갈락토스 에피토프의 발현이 감소되거나 제거된 다른 유제동물을 생성할 수 있다.
필요한 경우, 소과 동물 해면 상뇌증 (BSE)과 같은 잠재적인 감염 위험성을 감소시키기 위해 유제동물 프리온 유전자를 돌연변이시키거나 불활성화시킬 수 있다. 표적화 벡터의 제조를 위해, 실시예 1에 기재된 바와 같이 소과 동물 프리온 유전자의 게놈 DNA 서열 (진뱅크 허가번호 AJ298878)을 사용할 수 있다. 별법으로, 이 게놈 프리온 서열을 사용하여 다른 유제동물로부터 게놈 프리온 서열을 단리할 수도 있다. 프리온 유전자는 본원에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여 불활성화시킬 수 있다. 별법으로, 상기 기재된 양의 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 또는 프리온 유전자를 돌연변이화시키는 방법 [Denning et al., Nature Biotech., 19:559-562, 2001]은 본원에 기재된 교시 내용을 기초로 하여 변형될 수 있다. 예를 들어, 공여자 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포), 녹아웃 벡터 제조, 공여자 세포의 녹아웃 벡터로의 형질감염 (예를 들어, 스퍼미딘의 존재하에서의 형질감염) 및(또는) 녹아웃 세포로부터 트랜스제닉 유제동물의 생성에 사용되는 난모세포로의 유전 물질 전이에 대해 본원에 기재된 개선된 방법을 이용할 수 있다.
각 로커스의 제2 대립유전자를 표적화하기 위해, 만약 제1 선별 마커가 세포 내에 남아있다면, 상이한 선별 마커를 함유하는 신규 표적화 구조물을 조립해야만 할 수도 있다. 표 5에 기재된 바와 같이, 다양한 선별 전략을 입수할 수 있고, 이들을 서로 비교하여 적절한 선별 시스템을 선택할 수 있다. 우선, 약물 농도를 증가시켜 (예를 들어, 약물 농도를 2배 증가시켜) 제2 대립유전자를 표적화한다. 이것이 성공적이지 않을 경우, 신규 표적화 구조물을 사용할 수 있다.
| 선별가능한 마커 및 선별용 약물 | |
| 유전자 | 약물 |
| Neo r | G418 |
| Hph | 하이그로마이신 B |
| Puro | 퓨로마이신 |
| Ecogpt | 미코페놀산 |
| Bsr | 블라스티시딘 S |
| HisD | 히스티디놀 |
| DT-A | 디프테리아 독소 |
다양한 방법론을 이용하여, 상기 언급된 추가의 돌연변이 또는 유전자 불활성화를 본 발명의 유제동물에 혼입시킬 수 있다. 목적하는 각 돌연변이에 대해 트랜스제닉 유제동물 세포주가 생성되면, 잡종교배를 이용하여 상기 추가의 돌연변이를 본원 발명의 유제동물에 혼입시킬 수 있다. 별법으로, 상기 추가의 돌연변이를 갖는 태아 섬유아세포가 내인성 Ig 유전자의 녹아웃 및(또는) 이종 Ig 유전자의 도입을 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 또한, 내인성 Ig 유전자 내에 녹아웃 돌연변이를 갖고(갖거나) 이종 Ig 유전자를 함유하는 태아 섬유아세포가 상기 추가의 돌연변이 또는 불활성화를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
Ig 로커스의 표적화 결실
표적화 구조물을, 예를 들어 전기천공에 의해 배아 섬유아세포에 도입한다. 이 표적화 벡터를 혼입시킨 세포는 적절한 항생제를 사용하여 선별한다. 선택된 약물에 대해 내성이 있는 클론을 선별하여 증식시킨다. 이어서, 이들 클론을 간시클로버 (gancyclovir)로 음성 선별함으로써 적절하게 통합된 클론들을 선별한다. 별법으로, 약물 선별에서 생존한 클론들을 PCR에 의해 선별한다. 적절하게 표적화된 클론을 찾아내기 위해서는 적어도 500 내지 1000개의 클론들을 스크리닝해야 할 것으로 예상된다. 발명자들의 예상은, IgM 중쇄 불변 영역의 막 도메인을 표적화하는 경우에 300개의 neo 내성 클론들 중 약 1개가 적절하게 표적화되었다는 것을 발견한 기따무라의 발견 [Kitamura et al., Nature 350:423-6, 1991]에 기초한 것이다. 따라서, 96웰 플레이트에 10개의 클론으로 이루어진 군으로 클론들을 취합하고, 10개의 클론으로 이루어진 수집물(pool)을 선택된 표적화 클론에 대해 스크리닝하는 것이 제안된다. 양성 반응이 확인되면, 취합된 클론으로부터 단리된 단일 클론들을 스크리닝한다. 이 방법으로 표적화된 클론을 확인할 수 있다.
섬유아세포가 배양액 중에서 이동하기 때문에, 배양 접시 1개 당 약 10개가 넘는 클론이 생성될 경우에는 각각의 클론을 구별하는 것이 어렵다. 추가로, 고효율로 형질감염되는 클론 증식 전략이 개발될 수 있다. 여러 가지 합리적인 전략, 예를 들어 희석 클로닝이 이용될 수 있다.
약물 내성 마커의 Cre/Lox 절단
상기 나타낸 바와 같이, 예시적인 표적화 구조물은 loxP 부위가 인접한 선별 마커를 함유하기 때문에, cre/lox 시스템을 이용한 마커의 효율적인 결실이 용이하다. 표적화 벡터를 보유하는 태아 섬유아세포를 Cre 함유 플라스미드로의 전기천공에 의해 형질감염시킨다. GFPcre 융합 유전자를 함유하는, 최근에 기재된 Cre 플라스미드를 사용할 수 있다 [Gagneten S. et al., Nucleic Acids Res. 25:3326-31 (1997)]. 이는 Cre 단백질을 함유하는 모든 클론의 신속한 선별을 가능하게 한다. 이들 세포는 FACS 분류에 의해 또는 미세조작을 통한 녹색 형광 세포들의 수작업 수집에 의해 선별된다. 녹색 세포는 활동적으로 전사되는 Cre 리컴비나제 (recombinase)를 보유할 것으로 예상되고, 따라서 약물 내성 마커를 결실시킬 것으로 예상된다. Cre 발현에 대해 선별된 세포를 클로닝하고, PCR 분석을 통해 클론들의 약물 내성 마커 결실 여부를 분석한다. 절단이 발생한 것으로 결정된 세포들을 작은 클론으로 증식시키고, 이를 나누어 분취액 하나를 선별 배지에서 시험함으로써, 약물 내성 유전자가 결실되었음을 확실히 확인한다. 나머지 분취액을 다음 라운드의 표적화 결실에 사용한다.
다른 유제동물의 이뮤노글로불린 유전자 변형을 위한 표적화 전략의 적용
다른 유제동물의 이뮤노글로불린 유전자를 변형시키기 위해, 3개의 주요 영역을 함유하도록 표적화 벡터를 설계한다. 제1 영역은 표적화될 로커스와 상동성이다. 제2 영역은 표적화된 로커스의 일부를 특이적으로 교체하는 약물 선별 마커이다. 제3 영역은 제1 영역과 마찬가지로 표적화된 로커스와 상동성이지만, 야생형 게놈의 제1 영역과 인접하지는 않는다. 표적화 벡터와 목적 야생형 로커스 사이에서 상동 재조합이 일어나면 표적화 벡터에 존재하는 2개의 상동성 영역 사이에서 로커스 서열이 결실되고, 이 서열은 약물 내성 마커를 포함하는 서열로 교체된다. 바람직한 실시양태에서, 2개의 상동성 영역의 전체 크기는 대략 6 kb이고, 표적화된 로커스의 일부를 교체하는 제2 영역의 크기는 대략 2 kb이다. 이 표적화 전략은 원핵 세포부터 인간 세포에 이르기까지 광범위한 종에서 널리 유용하다. 사용되는 각 벡터의 독특함은 유전자 표적화 과정 및 그 전략에서 사용된 서열에 대해 선택된 로커스에 존재한다. 이러한 접근법은 염소 (카프라 히르쿠스; Capra Hyrcus ), 양 (오비스 아리에스; Ovis aries ) 및 돼지 (수스 스크루파; Sus scrufa ) 뿐만 아니라 소 (보스 타우루스; Bos taurus ) 등의 모든 유제동물에 이용될 수 있다.
유제동물 세포에서 특이적인 유전자를 표적화하는 데 이용되는 전기천공은 또한 유제동물에서 널리 이용될 수 있다. 본원에 기재된 일반적인 방법을 적용하여 표적화된 돌연변이를 다른 유제동물의 게놈으로 도입시킬 수 있다. 전기천공 조건 (전압 및 전기 용량)은 다른 유제동물로부터 수득한 형질감염체의 수가 최적화되도록 변형하여 이용할 수 있다.
또한, 소에서 중쇄 로커스를 표적화하기 위해 본원에서 이용된 전략 (즉, 제거될 엑손 바로 측면에 위치하는 영역과 상동성인 영역을 함유하는 벡터를 사용하여 모든 코딩 엑손 및 개재된 서열을 제거함)을 다른 유제동물에서도 동등하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 양 (오비스 아리에스; Ovis aries )의 이뮤노글로불린 중쇄 로커스에서 대규모 서열 분석을 수행하였으며, 양 로커스는 구조 및 서열 둘 모두가 소과 동물 로커스와 매우 유사하였다 (진뱅크 승인 번호 Z71572, Z49180 내지 Z49188, M60441, M60440, AF172659 내지 AF172703). 재배열된 오비스 아리에스 ( Ovis aries ) 이뮤노글로불린 쇄에 대해 보고된 다수의 cDNA 서열 이외에도, 중쇄 5' 인핸서 (진뱅크 승인 번호 Z98207), 3' 뮤 스위치 영역 (Z98680) 및 5' 뮤 스위치 영역 (Z98681)을 비롯한 중쇄 로커스에 대한 게놈 서열 정보가 보고되어 있다. 양으로부터 분비된 중쇄 형태에 대한 완전한 mRNA 서열은 승인 번호 X59994로 기탁되어 있다. 이 기탁물은 상응하는 소과 동물 서열에 매우 상동성인 4개의 코딩 엑손의 전체 서열을 함유한다.
양 로커스에 대한 정보를 진뱅크로부터 수득하여, PCR 분석에 사용되는 프라이머 설계를 위해 소과 동물 서열과 고도로 상동성인 영역을 결정하는 데 이용하였다. 동계유전자가 아닌 DNA를 소과 동물 세포의 표적화에 사용하였기 때문에, 양 서열과 고도로 상동성인 영역을 발견하는 것을, 소의 자손들 사이에 서열이 유사하게 보존되어 있다는 것을 나타내는 지표로 이용하였다. 소과 동물과 양과 동물의 이뮤노글로불린 로커스에 대한 서열 및 구조 사이에 유사성이 있다면, 소과 동물 이뮤노글로불린 로커스 제거에 이용되는 표적화 전략이 양과 동물 시스템에도 성공적으로 적용될 수 있을 것으로 예상된다. 돼지 (수스 수크루파, Sus scrufa ; 승인 번호 S42881) 및 염소 (카프라 히르쿠스, Capra hyrcus ; 승인 번호 AF140603)에 대한 기존의 정보는 이 두 가지 종 모두의 이뮤노글로불린 로커스도 소과 동물 로커스와 충분히 유사하여 본 발명의 표적화 전략이 이용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 5: 소과 동물 IgM 녹아웃
하기 방법을 이용하여 이뮤노글로불린 중쇄 (뮤) 로커스의 대립유전자 하나가 상동 재조합에 의해 붕괴된 소과 동물 섬유아세포 세포주를 생성하였다. 한 카피의 네오마이신 내성 유전자로 교체한 뮤 로커스 (IgM 중쇄 유전자에 상응함)의 엑손 1 내지 4를 제거하여 IgM의 녹아웃을 위한 DNA 구조물을 제작하였다. 이 구조물을 사용하여, 핵 전달 과정에서 성공적으로 사용되는 네오마이신 내성 세포주를 수득하고, 이 세포주로부터의 포배를 수용자 소에 이식하였다. 또한, PCR 방법을 이용하여 이 포배들 중 몇몇을 시험함으로써 뮤 로커스 주변에 적절하게 표적화되어 삽입되었음을 확인하였다. 수득한 세포주 중 몇몇 세포주로부터 핵 전달 과정을 거쳐 생성된 포배는 이종접합성 IgM-녹아웃 태아가 임신되었음을 나타내었다. 또한, 단일 IgM 중쇄 (뮤) 녹아웃을 포함하는 수컷 및 암컷 세포주 둘 모두를 생산하였다. 이들 세포주로부터 클로닝된 동물들을 교배시키면 mu의 2개 카피 모두가 불활성화된 자손이 생성될 것으로 예상된다. 본원에 기재된 바와 같이, 이 자손을 프리온 녹아웃 유제동물과 교배하여 IgM 및 프리온 유전자가 돌연변이화된 자손을 생성할 수 있다. 별법으로, 실시예 1에 기재된 바와 같이 이 자손으로부터의 세포를 유전적으로 변형시켜 프리온 유전자의 대립유전자 중 하나 또는 둘 모두를 불활성화시킬 수 있다. 이 과정은 하기에서 보다 상세하게 논의하였다.
DNA 구조물
본원에 기재된 모든 형질감염에 사용되는 DNA를 하기와 같이 제작하였다. 4개의 주요 엑손 (막투과 도메인 엑손은 제외)인 CH1 내지 CH4를 하류 (CH4) 말단의 XhoI 제한효소 부위 및 상류 (CH1) 말단의 XbaI 부위의 측면에 위치시켰다. 형질감염 과정에 사용되는 구조물은 XhoI 부위 하류의 게놈 서열 1.5 kb와 XbaI 부위 상류의 게놈 서열 3.1 Kb로 이루어져 있다 (도 3D 및 3E). 이들 서열은 메사추세츠주의 낙농가로부터 입수한 홀스타인 암소로부터 본원에 기재된 바와 같이 단리하였다. 네오마이신 내성 마커를 3.5 Kb 단편 상의 상기 2개의 단편 사이에 삽입하여, 원래의 게놈 서열로부터 CH1 내지 CH4를 함유하는 2.4 Kb의 DNA를 교체하였다. 벡터의 백본은 pBluescriptII SK+ (Stratagene)이었으며, 8.1 Kb의 삽입물을 정제하여 소과 동물 태아 섬유아세포의 형질감염에 사용하였다. 이 구조물을 도 3A 내지 3C에 나타내었다. 표준 방법을 이용하여 다른 상동성 영역 및(또는) 다른 항생제 내성 유전자를 함유하는 다른 뮤 녹아웃 구조물을 제조할 수 있고, 이를 내인성 뮤 중쇄 유전자의 돌연변이화에 사용할 수 있다.
형질감염/녹아웃 과정
소과 동물의 태아를 형질감염시키는 과정을 시판되는 시약인 슈퍼펙트 형질감염 시약 (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
헤마테크 캔사스 (Hematech's Kansas) 시설에서 질병-시험된 수컷 샤롤레 (Charolais) 소로부터 소과 동물 섬유아세포를 제작하여, 기재된 모든 실험에 사용하기 위해 헤마테그 웨세스터 분자생물학 실험실 (Hematech's Worcester Molecular Biology Lab)로 보냈다. 임의의 다른 유제동물 품종, 속 또는 종을 공여자 세포 (예를 들어, 태아 섬유아세포와 같은 체세포)의 공급원으로 사용할 수 있다. 공여자 세포를 기능적 내인성 Ig의 발현을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유하도록 유전적으로 변형시켰다.
소과 동물 태아 섬유아세포 배양에 사용되는 배지는 하기 성분으로 이루어져 있다: 알파 MEM (Bio-Whittaker ＃12-169F) 500 ml; 소과 동물 태아 혈청 (Hy-Clone ＃A-1111-D) 50 ml; 항생제/항유사분열제 (Gibco/BRL ＃15245-012) 2 ml; 2-메르캅토에탄올 (Gibco/BRL ＃21985-023) 1.4 ml; L-글루타민 (Sigma Chemical ＃G-3126) 5.0 ml; 및 트립신 타르트레이트 (Sigma Chemical ＃T-6134) 0.5 ml.
형질감염시키기 하루 전에, 현미경 조사에 의해 측정시 40-80％가 표적화 융합되도록 60 mm 조직 배양 접시에 세포를 시딩하였다.
형질감염시키는 당일에, DNA 5 ㎍이 첨가된 총 부피 150 ㎕의 혈청-무함유, 항생제-무함유 배지를 슈퍼펙트 형질감염 시약 20 ㎕와 함께 혼합하고, 실온에서 5 내지 10분 동안 방치하여 DNA-슈퍼펙트 복합체가 형성되도록 하였다. 복합체가 형성되는 동안, 형질감염될 소과 동물 섬유아세포를 함유하는 60 mm 조직 배양 접시로부터 배지를 제거하고, 세포를 인산염-완충된 염수 4 ml로 1회 세정하였다. 증식 배지 1 ml를 DNA/슈퍼펙트 혼합물 170 ㎕에 첨가하고, 즉시 60 mm 접시에 담긴 세포에 넣었다. 세포를 38.5 ℃, 50％ 이산화탄소에서 2.5시간 동안 배양하였다. 세포를 DNA/슈퍼펙트 복합체와 함께 배양한 후, 배지를 흡인에 의해 제거하고, 세포를 PBS 4 ml로 4회 세척하였다. 완전 배지 5 ml를 첨가하고, 배양물을 38.5 ℃, 5％ CO 2 에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 현미경 관찰에 의해 측정시 세포가 플레이트로부터 떨어질 때까지 37 ℃에서 PBS 중 0.3％ 트립신 1 ml와 함께 배양하였다. 각각의 60 mm 접시로부터의 세포를 24 웰 조직 배양 플레이트의 24개의 웰에 분배하였다 (41.7 ㎕/웰). 각각의 웰에 조직 배양 배지 1 ml를 첨가하고, 플레이트를 38.5 ℃에서 24시간 동안, 및 5％ C0 2 에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
모든 형질감염 과정 동안, DNA를 함유하지 않는 슈퍼펙트/PBS 혼합물을 사용하여 샴(sham) 형질감염을 수행하였으며, 이들 중 어떠한 세포도 네오마이신 내성 유전자를 함유하지 않으며, 조직 배양 배지에 G418를 첨가한 후에는 모든 세포가 사멸할 것으로 예상되었다. 이는 DNA를 수득한 세포의 양성 선별법에 대한 음성 대조군으로 사용하였다.
24시간 동안 배양한 후, G418 400 ㎍을 함유하는 조직 배양 배지를 1 ml 이상 각각의 웰에 첨가하여 최종 G418 농도가 200 ㎍/ml가 되도록 하였다. G418 선별을 위해 7일 동안 세포를 다시 인큐베이터에 넣어두었다. 이 기간 동안, 형질감염 플레이트 및 샴 형질감염 플레이트 둘 모두를 7일에 걸쳐 세포 사멸에 대해 모니터링한 결과, 거의 대다수의 샴 형질감염 플레이트 웰은 살아있는 세포를 거의 또는 전혀 함유하지 않았지만, DNA를 수득한 세포를 함유하는 플레이트는 훌륭한 세포 증식을 나타내었다.
7일 동안 선별한 후, 90-100％ 전면생장된 웰로부터의 세포를 PBS 중 0.3％ 트립신 0.2 ml를 사용하여 떼어내고, 확장용 35 mm 조직 배양 플레이트로 옮기고, 이들을 50％ 이상 전면생장될 때까지 배양하고, 이 시점에서 세포를 PBS 중 0.3％ 트립신 0.6 ml으로 처리하였다. 추가로 확장시키기 위해 각각의 35 mm 조직 배양 플레이트로부터 0.6 ml의 세포 현탁액 중 0.3 ml를 12.5 cm 2 조직 배양 플라스크로 옮겼다. 남은 0.3 ml를 35 mm 접시에 다시 시딩하고, 이들의 최소 전면생장도가 대략 50％가 될 때까지 배양하고, 이 시점에서 PCR 분석용 DNA 추출을 위해 상기 플레이트로부터의 세포를 가공하였다. 상기 분석이 완료될 때까지 각 라인으로부터의 플라스크를 인큐베이터에 넣어두고, 이들이 목적 DNA 통합을 함유하지 않는 경우에는 종결시키고, 함유할 경우에는 이후의 핵 전달 과정 및 동결보존 과정에 사용하기 위해 보관하였다.
표적화된 통합에 대한 스크리닝
상기 기재된 바와 같이, DNA 구조물을 함유하는 형질감염체 스크리닝용 DNA 공급원은 분석될 일련의 세포를 함유하는 35 mm 조직 배양 접시였다. DNA를 하기와 같이 제조하고, 레어드 등 (Laird et al.)에 의해 공개된 방법 (문헌 [Laird et al., Nucleic Acids Res., 19:4293])으로 개조시켰다. 요컨대, DNA를 하기와 같이 제조하였다. 세포 용해 완충액을 하기 성분으로 제조하였다: 100 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.5); 5 mM EDTA (pH 8.0); 0.2％ 나트륨 도데실 술페이트; 200 mM NaCl; 및 100 ㎍/ml 프로테이나제 K.
각각의 35 mm 조직 배양 접시로부터 배지를 흡인하고, 상기 완충액 0.6 ml로 교체하였다. 접시를 다시 3시간 동안 인큐베이터에 넣어 세포 용해 및 단백질 분해가 발생하도록 하였다. 인큐베이션한 후, 용해물을 1.5 ml 미세원심분리 튜브로 옮기고, 이소프로판올 0.6 ml를 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 튜브를 뒤집어서 완전히 진탕하고, 실온에서 3시간 동안 방치한 후, DNA 침전물을 13,000 rpm으로 10분 동안 미세원심분리기에서 회전시켜 가라앉혔다. 각각의 튜브로부터 상등액을 제거하고, 펠릿을 70％ 에탄올로 1회 세정하였다. 70％ 에탄올을 흡인에 의해 제거하고, DNA 펠릿을 공기-건조시켰다. 일단 건조되면, 각각의 펠릿을 Tris (10 mM)-EDTA (1 mM) 완충액 (pH 7.4) 30-50 ㎕에 재현탁하고, 밤새 수화 및 가용화시켰다. 각각의 DNA 용액 5-7 ㎕를 각각의 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 과정에 사용하였다.
두가지 개별 PCR 과정을 이용하여 형질감염체를 분석하였다. 제1 과정에서는 형질감염에 사용되는 DNA에 위치하는 부위에 어닐링할 것으로 예상되는 2개의 프라이머를 사용하였다. 제1 프라이머 서열은 DNA 구조물의 네오마이신 내성 카세트와 상동성이고, 제2 프라이머는 대략 0.5 Kb만큼 떨어져 위치하며, 0.5 Kb의 짧은 PCR 산물이 생성된다. 구체적으로, 프라이머 Neo1 (5'-CTT GAA GAC GAA AGG GCC TCG TGA TAC GCC-3', 서열 42) 및 IN2521 (5'-CTG AGA CTT CCT TTC ACC CTC CAG GCA CCG-3', 서열 43)을 사용하였다. 이 PCR 반응에 퀴아젠 PCR 키트를 사용하였다. PCR 반응 혼합물은 각각의 프라이머 1 pmole, 10X 반응 완충액 5 ㎕, Q 용액 10 ㎕, DNA 5 ㎕ 및 dNTP 용액 1 ㎕를 함유하였다. H 2 O를 사용하여 반응 혼합물의 총 부피를 50 ㎕가 되도록 하였다. PCR 증폭 과정은, 처음에 94 ℃에서 2분 동안 인큐베이션하여 변성시키는 조건을 이용하여 수행하였다. 이어서, 94 ℃에서 45초, 60 ℃에서 45초, 및 72 ℃에서 2분 동안 인큐베이션함으로써 변성, 어닐링 및 증폭 과정을 30주기 수행하였다. 이어서, 반응 혼합물을 72 ℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 4 ℃에서 혼합물이 PCR 기기로부터 분리될 때가지 인큐베이션하였다. 별법으로, 세포의 게놈에 통합된 녹아웃 구조물 영역과 상동성인 임의의 다른 프라이머를 적절한 반응 조건하에서 표준 PCR 반응에 사용하여, G418 선별 과정에서 생존한 세포가 DNA 구조물의 통합에 의해 내성을 갖게 되었는지 확인하였다.
적은 비율의 형질감염체만이 목적하는 위치 (뮤 로커스)에 DNA가 통합될 것으로 예상되기 때문에, 다른 프라이머 쌍을 사용하여 도입된 DNA가 형질감염체의 게놈에 존재하는지 뿐만 아니라 이들이 목적하는 위치에 통합되었는지를 결정하였다. 적절한 통합을 검출하기 위해 이용되는 PCR 과정은 DNA가 IgM 로커스의 적절한 부위에 통합되는 경우에만, DNA 구조물의 네오마이신 내성 카세트 내에 위치하는 프라이머 1개와 1.8 Kb 떨어진 위치에 어닐링할 것으로 예상되는 프라이머 1개를 사용하여 수행하였다 (상동성 영역이 형질감염에 사용되는 DNA 구조물에 포함된 영역 외부에 존재하기 때문). 프라이머는, 목적하는 위치에 통합되는 경우 DNA 구조물에서 나타나는 서열에 바로 인접하는 DNA 서열에 어닐링되도록 설계하였다 (DNA 구조물에 존재하는 영역 내부에 있으며 게놈에서 이들과 인접하고 있는 로커스의 DNA 서열을 미리 결정함). 구체적으로, 프라이머 Neo1 및 OUT3570 (5'-CGA TGA ATG CCC CAT TTC ACC CAA GTC TGT C-3', 서열 44)를 이 분석에 사용하였다. 상기 PCR 반응을 퀴아젠 PCR 키트를 사용하여 1차 PCR 반응에 대해 상기 기재된 바와 같이 수행함으로써 표적화 구조물이 세포에 통합되었는지 확인하였다. 별법으로, 이 PCR 분석을 세포 게놈에 통합된 녹아웃 구조물 영역과 상동성인 임의의 다른 프라이머 및 통합 부위의 상류 또는 하류에 위치하는 세포 게놈 영역과 상동성인 임의의 다른 프라이머를 사용하고, 임의의 적절한 반응 조건을 이용하여 수행하였다.
이러한 방법을 이용하여, 135개의 개별 35 mm 플레이트를 DNA 구조물이 적절한 로커스에 표적화되어 통합되었는지에 대해 스크리닝하였다. 이들 중 8개의 플레이트로부터의 DNA가 적절하게 표적화된 DNA 구조물을 함유하는 것으로 측정되었으며, 이들 중 3개를 핵 전달 과정에 사용하기 위해 선별하였다. 상기 세포주를 "8-1C", "5-3C" 및 "10-1C"로 명명하였다. 수용자 암소로 전달하는 데 사용하지 않고 남은 포배를 사용하여 추가로 PCR 분석될 DNA를 추출하였다. 이 분석은 형질감염된 세포주의 최초 스크리닝에서도 사용되는 프라이머를 사용하는, 네스티드(nested) PCR 과정을 이용하는 효과적인 것이었다.
상기 언급한 바와 같이, 뮤 로커스의 엑손 1 내지 4를 제거하도록 설계된 유전자 표적화 구조물을 사용하여 3종의 세포주를 생성하였다. 이들 세포주 모두는 PCR 기초의 시험을 이용한 표적화 삽입에 대해 양성으로 시험되었고, 핵 전달 과정에 사용하였다. 상기 핵 전달 과정으로부터 생성된 남은 포배를, 적절하게 표적화된 구조물을 시험하는 PCR에 의해 스크리닝하였다. 하기와 같은 양성 포배 빈도수를 수득하였다:
세포주 8-1C: 6/8
세포주 10-1C: 2/16
세포주 5-3C: 0/16
임신 제40일에, 초음파에 의해 총 11마리가 임신한 것으로 감지되었으나, 임신 제60일이 되자 7마리의 태아가 사망하였다. 남아있는 4마리의 태아를 새로운 태아 섬유아세포를 생성하도록 처리하고, 남아있는 기관을 사용하여 PCR 분석용의 작은 조직 샘플을 제조하였다. 분석 결과는 다음과 같다:
세포주 8-1C: 2마리의 태아, 1마리의 태아가 PCR에 의한 표적화된 삽입에 양성임
세포주 10-1C: PCR에 의한 표적화된 삽입에 양성인 1마리의 태아
세포주 5-3C: PCR에 의한 표적화된 삽입에 음성인 1마리의 태아
놀랍게도, 표적화된 삽입에 대해 양성인 10-1C 포배의 비율이 2/16밖에 되지 않았지만, 이 세포주로부터 수득한 임신 제60일까지 살아있는 한 마리의 태아가 PCR에 의해 측정시 양성이었다. 8-1C로부터의 양성 태아도 수득하였다. 모든 조직 샘플의 DNA에 대한 서던 블롯팅 분석을 수행하여, 한 말단에 정확하게 표적화되었을 뿐만 아니라 (원래의 구조물에 존재하는 짧은 상동성 영역의 PCR에 의해 측정함) 다른 말단에서도 정확하게 표적화된 구조물을 확인하였다. 현재까지의 결과를 기초로 하여, 두가지 독립적인 통합 사건으로부터 2마리의 중쇄 녹아웃 태아가 생산된 것으로 믿어지고 있다. 또한, 이들 태아는 두가지 다른 세포주로부터 유래되었기 때문에, 적어도 하나 이상이 양쪽 말단에 정확하게 통합된 구조물을 포함할 것이다. 서던 블롯팅 분석으로 표적화 구조물의 양쪽 말단에 적절하게 표적화되었음을 확인하였기 때문에, 추가로 핵 전달 과정을 수행하여 일정 기간까지 보유되는 추가의 태아를 생성하였다.
핵 전달 및 배아 전달
핵 전달 과정을 K/O 세포주 (8-1-C (18))로 수행하여 8개의 배아를 생산하였다. 이 배치로부터 총 6개의 배아를 3마리의 질병에 걸리지 않은 수용자에게 전달하였다 [Trans Ova Genetics ("TOG"; Iowa)].
동결된 배아를 10마리의 질병에 걸리지 않은 수용자에게 전달하여 질병에 걸리지 않은 암컷 섬유아세포 세포주를 수득하였다. 제35일 내지 제40일 되는 날 임신을 확인한 후에 태아를 회수하기로 하였다.
임신 진단 및 태아 회수
녹아웃 태아 세포로부터 클로닝된 배아를 전달받은 18마리 수용자의 임신 상태를 초음파촬영술에 의해 확인하였다. 그 결과를 표 6에 요약하였다.
| 뮤 중쇄 녹아웃 공여자 세포를 이용한 제40일의 임신 | ||
| 클론 ID | 전달받은 수용자의 수 | 제40일의 임신율 (％) |
| 8-1-0C | 5 | 4 (80) |
| 10-1-C | 6 | 4 (67) |
| 5-3-C | 5 | 3 (60) |
| 합계 | 16 | 11 (69) |
임신 진단
녹아웃 세포(8-1C)로부터 클로닝된 배아를 전달받은 3마리의 수용자의 임신 상태를 확인하였다; 한 마리는 확인되었고, 다른 두 마리는 한 달 후에 재확인이 요구되었다.
태아 회수 및 세포주 확립
K/O 배아로 임신시킨 11마리의 임신 제40일된 개체를 수득하였다. 4마리의 살아있는 태아를 임신 제60일에 분리하였다. 세포주를 모든 4마리의 태아로부터 제조하고, 이후의 사용을 위해 동결보존하였다. 또한, 본 발명자들은 태아로부터의 동결된 조직 샘플을 수집하여 모으고, 이들을 PCR/서던 블롯팅 분석을 위해 헤마테크(Hematech) 분자생물학 실험실로 보냈다.
4가지 세포주는 모두 수컷이었다. 암컷 세포주를 보호하기 위하여 세포주를 제조하고, 질병에 걸리지 않은 수용자 (Trans Ova Genetics)의 임신으로부터 임신 제55일에 수집한 태아 (6마리)로부터의 이후의 K/O 세포 제조를 위해 동결보존하였다. 최근, 뮤 녹아웃을 함유하는 암컷 세포주가 존재한다는 것을 확인하였다. 이 암컷 세포주를 사용하여 수컷 세포주로부터 생성된 동물과 교배될 수 있는 복제 동물을 생산하였으며, 그 자손을 이중 뮤 녹아웃을 함유하는 세포주에 대해 스크리닝하였다.
필요한 경우, 생성된 녹아웃 태아 또는 녹아웃 자손으로부터의 세포를 제2 라운드 핵 전달 과정에 사용하여 추가의 복제 자손을 생산할 수 있다. 또한, 최초의 녹아웃 태아 또는 녹아웃 자손으로부터의 세포를 동결시켜, 추가의 녹아웃 유제동물 생산에 사용하는 공여자 세포의 공급원으로 사용될 세포주를 형성할 수도 있다.
실시예 6: 환원된 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 갖는 트랜스제닉 유제동물
필요한 경우, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 돌연변이화된 트랜스제닉 유제동물을 생성하여, 갈락토스 α-(1,3)-갈락토스 에피토프를 갖는 이종 항체가 원치않게 글리코실화되는 것을 방지할 수 있다. α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 로커스의 한 대립유전자가 돌연변이화된 소과 동물 섬유아세포 세포주를 상동 재조합에 의해 생성하였다. α-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 세포를 생성하기 위한 DNA 구조물을 사용하여, 퓨로마이신-내성 유전자 (본원에 puro로 기재되어 있음) 및 전사 종결 카세트 (STOP) 둘 모두를 촉매 도메인을 함유하는 엑손 9에 삽입함으로써 기능적 전장 α-갈락토실트랜스퍼라제 mRNA의 전사를 방지하였다. 따라서, 생성된 미성숙 α-갈락토실트랜스퍼라제 전사체는 촉매 도메인이 결실되어 있다. 3가지 각 소과 동물 섬유아세포 세포주를 전기천공하여 DNA 구조물 (즉, α-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 벡터)을 넣은 다음, 퓨로마이신-내성 콜로니를 단리하였다. PCR 분석에 기초하여, 엑손 9 영역에서의 상동 재조합이 몇몇 콜로니에서 발생하였다. 이와 같이, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 로커스의 한 대립유전자가 돌연변이화된 소과 동물 섬유아세포 세포주가 생성되었다. 필요한 경우, 제2 대립유전자를 동일한 녹아웃 벡터와 동종접합성 녹아웃 세포를 선별하기 위한 고농도의 항생제를 사용하거나, 또는 다른 항생제 내성 유전자를 갖는 다른 녹아웃 벡터를 사용하여 돌연변이화시킬 수 있다. 이 방법을 다른 유제동물로부터의 세포에 적용하여 본 발명의 트랜스제닉 유제동물을 생산하기 위해 본원에 기재된 핵 전달 방법에 사용되는 트랜스제닉 세포를 생성할 수 있다.
이 방법은 하기에 더 기재되어 있다.
α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 벡터의 제작
α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 벡터를 하기와 같이 제작하였다 (도 23). α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 엑손 9 주변의 게놈 DNA를 단리하기 위하여, DNA 프로브를 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다: 5'-gat gat gtc tcc agg atg cc-3' (서열 61) 및 5'-gac aag ctt aat atc cgc agg-3' (서열 62). 이 프로브를 사용하여 소과 동물 게놈 λ 파지 라이브러리를 스크리닝하여 7개의 양성 λ 파지 클론을 확인하였다. 수컷 샤롤레 소과 동물 섬유아세포로부터의 DNA를 함유하는 클론 1개를 제한 지도작성(restriction mapping)에 의해 추가로 분석하였다. 엑손 9를 함유하는 NotI-XhoI 게놈 단편을 pBluescriptII SK(-)에 서브클로닝한 후, puro 및 STOP 카세트 둘 모두를 촉매 도메인에 대해 5'인 NotI-XhoI 게놈 단편에 존재하는 AviI 부위에 삽입하였다. 또한, 표적화 카세트가 비-상동성으로 통합된 세포를 사멸시키기 위해 디프테리아 독소 유전자 (DT-A, Gibco)를 벡터 구조물에 추가하였다.
형질감염/녹아웃 과정
3개의 태아 섬유아세포 세포주 (2개는 수컷 저지 소과 동물로부터의 세포주이고 나머지 하나는 암컷 저지 소과 동물로부터의 세포주임)를 하기와 같이 표준 전기천공 프로토콜을 이용하여 형질감염시켰다. 소과 동물 태아 섬유아세포 배양에 사용된 배지는 알파 MEM (Gibco, 12561-049) 500 ml, 소과 동물 태아 혈청 (Hy-Clone ＃ABL13080) 50 ml, 페니실린-스트렙토마이신 (SIGMA) 5 ml 및 2-메르캅토에탄올 (Gibco/BRL ＃21985-023) 1 ml를 함유하였다. 형질감염시키기 하루 전에, 현미경 조사에 의해 측정시 표적화된 전면생장도가 80-100％가 되도록 T175 조직 배양 플라스크에 세포를 시딩하였다. 형질감염시키는 당일에, 약 10 7 개의 소과 동물 섬유아세포를 트립신으로 처리하고, 알파-MEM 배지로 1회 세척하였다. 세포를 알파-MEM 800 ㎕로 재현탁한 후에, DNA 30 ㎍을 세포 현탁액에 첨가하고, 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 세포-DNA 현탁액을 전기천공 큐벳으로 옮기고, 1,000 V 및 50 μF에서 전기천공하였다. 이후에, 전기천공된 세포를, 혈청을 보충한 알파-MEM 배지가 포함된 20개의 24-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 48시간 동안 배양한 후에, 배지를 퓨로마이신 1 ㎍/ml를 함유하는 배지로 교체하고, 세포를 2 내지 3주 동안 배양하여 퓨로마이신 내성 세포를 선별하였다. 선별한 후에, 거의 100％ 전면생장된 모든 콜로니를 찍어내고, 이 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출하여 PCR로 목적하는 상동 재조합 반응에 대하여 스크리닝하였다.
표적화된 통합에 대한 스크리닝
상기 기재된 바와 같이, 퓨어진(PUREGENE) DNA 단리 키트 (Gentra Systems)를 제조업자의 프로토콜에 따라 이용하여 각각의 24-웰로부터 독립적으로 게놈 DNA를 추출하였다. 각각의 게놈 DNA 샘플을 10 mM Tris-Cl (pH 8.0) 및 1 mM EDTA (EDTA) 20 ㎕에 재현탁하였다. 하기 프라이머 쌍을 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하였다: 5'-aag aag aga aag gta gaa gac ccc aag gac-3' (서열 63) 및 5'-cct ggg tat aga cag gtg ggt att gtg c-3' (서열 64). 한 프라이머의 서열은 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 녹아웃 벡터에 위치하고, 다른 프라이머의 서열은 표적화된 내인성 로커스에 통합된 벡터의 바로 외부에 위치한다 (도 23). 따라서, 예상되는 PCR 산물은 녹아웃 벡터가 상동 재조합에 의해 표적화된 로커스에 통합된 경우에만 검출될 것이다.
PCR 반응 혼합물은 물 18.9 ㎕, 10X LA PCR 완충액 II (Mg 2+ 첨가) 3 ㎕, dNTP 혼합물 4.8 ㎕, 10 pmol의 정방향 프라이머, 10 pmol의 역방향 프라이머, 게놈 DNA 1 ㎕, 및 LA Taq 0.3 ㎕를 함유하였다. 반응 혼합물을 하기 조건에서 인큐베이션함으로써 PCR 반응을 40주기 수행하였다 :85 ℃에서 3분 동안, 94 ℃에서 1분 동안, 98 ℃에서 10초 동안 및 68 ℃에서 15분 동안. PCR 수행 후에, 반응 혼합물을 전기영동법에 의해 분석하였다. 예상되는 크기의 PCR 산물을 생성하는 퓨로마이신-내성 클론을 선별하였다 (도 23). 이와 같이, α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 로커스의 한 대립유전자가 녹아웃 벡터에 의해 돌연변이화된 소과 동물 섬유아세포 세포주가 성공적으로 생성되었다.
실시예 7: 내인성 유전자 돌연변이화를 위해 아데노-관련 바이러스를 사용하는, 트랜스제닉 유제동물을 생산하는 다른 방법
아데노-관련 바이러스 (AAV)는 세포의 게놈에 존재하는 표적화 서열의 특이적 치환에 사용될 수 있다 [Inoue et al., Mol. Ther. 3:526-530, 2001; Hirata et al., J. Virol. 74:16536-16542, 2000; Inoue et al., J. Virol. 73:7376-7380, 1999; and Russell et al., Nat. Genet. 18:325-330, 1998]. 유전자 표적화 속도는 보다 통상적인 유전자 표적화 접근법에 비해 상당히 효율적이었다. AAV는 광범위한 숙주 및 조직 특이성을 가지며, 이는 소과 동물과 인간 모두의 피부 섬유아세포에 대한 특이성을 포함한다. 따라서, AAV는 내인성 이뮤노글로불린 (예를 들어, 뮤 중쇄, 람다 경쇄, 카파 경쇄 또는 J 쇄), 알파-(1,3)-갈락토실트랜스퍼라제 또는 프리온 유전자에 하나 이상의 돌연변이가 함유된 트랜스제닉 유제동물 세포를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이후에, 이 트랜스제닉 세포를 본원에 기재된 핵 전달 방법에 사용하여 본 발명의 트랜스제닉 유제동물을 생산할 수 있다.
AAV를 사용하면 소과 동물 이뮤노글로불린 중쇄 로커스에서의 상동 재조합이 기존에 통상적인 유전자 표적화 전략 (즉, 전기천공 및 리포형질감염 과정)을 이용하여 수득하였을 때보다 높은 빈도수로 발생하였다. 제1 라운드의 유전자 표적화 실험에서는, AAV 벡터를 통해 도입된 DNA를 함유하는 73개의 안정한 형질도입체 중에서 적절하게 표적화된 섬유아세포 클론 5개를 수득하였다.
상기 실험을 하기와 같이 수행하였다.
AAV 녹아웃 벡터
AAV 구조물은 간단하게 외부서열을 삽입하거나, 또는 내인성 서열을 AAV 벡터에 존재하는 새로운 서열로 치환함으로서 유전자를 붕괴시킬 수 있다. 도 24는 소과 동물 이뮤노글로불린 중쇄 뮤 불변 영역의 모든 코딩 엑손 4개가 2822개 염기쌍의 BamHI-XhoI 단편에 존재하는 AAV 구조물을 나타낸다. 상업적으로 이용가능한 벡터인 pMC1Neo에 존재하는 네오마이신 내성 마커를 함유하는 1.16 Kb의 단편을 홀스타인(Holstein) 소과 동물로부터의 뮤 중쇄 로커스의 엑손 4에 존재하는 SacII 부위에 삽입하였다. 이 로커스는 실시예 3에 기재된 녹아웃 벡터를 생성하기 위해 단리된 파지 클론에 함유된 로커스이다. AVV 벡터를 생성하기 위해, 뮤 중쇄 로커스의 SacII 부위를 채워 블런트 말단을 생성하였으며, 이는 이후에 블런트 SalI 링커 (New England Biolabs)에 라이게이션하였다. 이어서, 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 pMC1Neo의 XhoI 단편을 SalI 링커를 통해 로커스에 부가된 SalI 부위에 라이게이션하였다. XhoI 및 SalI 제한효소 부위가 상용가능한 말단을 갖기 때문에 이 라이게이션 과정을 수행할 수 있었다. 이 녹아웃 벡터는 네오마이신 내성 유전자가 내인성 뮤 중쇄 유전자에 삽입되어 유전자를 붕괴시키는 현상을 초래하며, 이에 따라 뮤 중쇄 유전자가 불활성화된다. 이 유전자 불활성화는 내인성 뮤 로커스의 영역을 결실시키지 않고 발생한다.
표적화 과정 동안 엑손 3 및 4를 내인성 로커스로부터 제거하여 상기 2개의 엑손을 네오마이신 내성 유전자의 기능적 카피로 치환하는 다른 벡터를 설계하였다 (도 25). 이 구조물은 암컷 저지 소과 동물로부터의 게놈 DNA를 PCR로 증폭시켜 생성하였다. 구체적으로, 3' 상동성 영역을 하기 프라이머를 사용하여 증폭시켰다: 5'-GGG GTC TAG Agc aga cac tac act gat ggg ccc ttg gtc c-3' (서열 65; XbaI 제한효소 부위가 부가됨) 및 5'-GGG GAA GCT Tcg tgt ccc tgg tc ctg tct gac aca g-3' (서열 66; HindIII 제한효소 부위가 부가됨). 5' 상동성 영역을 프라이머 5'-GGG GCT CGA Ggt cgg cga agg atg ggg gga ggt g-3' (서열 67; XhoI 제한효소 부위가 부가됨) 및 5'-GGG GGG TAC Cgc tgg gct gag ctg ggc aga gtg gg-3' (서열 68; KpnI 제한효소 부위가 부가됨)를 사용하여 증폭시켰다. 상기 프라이머 서열 중 대문자로 표현한 뉴클레오티드는 뮤 중쇄 로커스에 어닐링하지 않지만, 이후의 서브클로닝 단계를 용이하게 하는 제한효소 부위를 부가하기 위해 프라이머에 포함된 뉴클레오티드이다. 제한 효소는 프라이머 말단 부위를 내부 부위만큼 잘 절단하지 못하기 때문에, 처음 4개의 구아닌은 프라이머 말단으로부터 제한효소 부위를 분리하기 위해 부가하였다. 5' 상동성 영역은 1.5 Kb 길이이고, 엑손 1 및 2를 함유한다. 5' 상동성 영역은 또한 엑손 3의 처음 25개의 뉴클레오티드를 함유하여 엑손 3의 스플라이싱 허용 부위를 유지하였다. 이 스플라이싱 허용 부위는 엑손 3이 스플라이싱에 사용될 수 있도록 하며, 따라서 엑손 1 및 2가 하류 막투과 도메인으로 스플라이싱되어 변성된 막-결합 생성물을 형성할 수 있는 가능성을 방지한다. 3' 상동성 영역은 1.24 Kb 길이이며, 엑손 4 바로 아래 하류 영역을 함유한다.
도 24에 나타낸 구조물의 경우, 표준 방법을 이용하여 리안 (Ryan)등의 의해 보고된 (J. Virol. 70:1542-1553, 1996) AAV 벡터 (바이러스성 장쇄 말단 반복 (LTR) 서열 함유)에 표적화 카세트를 삽입하였다. AAV 벡터를 이미 기재된 바와 같이 TtetA2 패키징 세포주를 사용하여 캡시드 (capsid)에 패키징하고 [Inoue and Russell, 1998, J. Virol. 72:7024-7031, 1998], 이미 기재된 바와 같이 정제하였다 [Zolotukhin et al., Gene Therapy, 6:973-985, 1999]. 도 25에 나타낸 구조물의 경우, 상기 방법 또는 임의의 다른 표준 방법을 이용하여 표적화 카세트를 리안 (Ryan) 등에 의해 기재된 AAV 벡터 또는 임의의 다른 AAV 벡터 (예를 들어, 스트라타진 (Stratagene)사로부터 상업적으로 이용가능한 벡터)에 삽입하여 벡터를 함유하는 바이러스를 생성할 수 있다.
형질도입 과정
48-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 암컷 저지 소과 동물로부터의 섬유아세포를 웰 당 40,000개의 세포로 시딩하고, 완전 배지 중에서 세포가 웰의 바닥 표면에 부착될 때까지 38.5 ℃ 및 5％ CO 2 에서 배양하였다. 일단 세포가 부착되면, 배지를 제거하고, 500 내지 20,000개 입자/세포의 감염다중도 (MOI)로 도 24에 나타낸 벡터를 포함하는 AAV 입자를 함유하는 신선한 배지 0.2 ml로 교체하였다. 약물 선별 단계 동안 생성된 콜로니 수 및 콜로니들의 간격을 측정하는 파일럿 실험에 기초하여 MOI를 선택하였다. 플레이트를 밤새 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 과정 후에, 형질도입된 웰을 칼슘 및 마그네슘-무함유 PBS로 세정하고, 트립신 또는 상기 기재된 세포 해리 완충액을 사용하여 웰로부터 떼어냈다. 떨어진 세포를 부드럽게 피펫팅하여 균질한 세포 현탁액을 수득하였으며, 웰로부터의 세포를 10개의 100 mm 조직 배양 접시에 재분배하였다. 접시를 완전 배지와 함께 밤새 인큐베이션하였다.
100 mm 접시의 상기와 같은 인큐베이션 후, 배지를 350 ㎍/ml 농도의 G418을 함유하는 선별 배지로 교체하였다. 접시의 표면에서 콜로니가 육안으로 관찰될 때까지 선별 배지를 2 내지 3일 마다 교환하였다. 이 시점에서, 각각의 콜로니를 찍어내어 이들의 자체 용기에 넣었다.
콜로니를 함유하는 영역을 조직 배양 접시의 외부 표면 상에 표시하였다. 일단 모든 콜로니가 원형이 되면, 배지를 흡인하여 플레이트로부터 제거하고, 플레이트를 칼슘 및 마그네슘-무함유 PBS로 3회 세척하였다. 세척한 후에, 플레이트를 1X 트립신의 1:25 희석액으로 가득 채우고, 콜로니가 플레이트의 표면으로부터 떨어지는 것이 관찰되기 시작할 때까지 실온에 방치하였다. 떨어진 콜로니가 플레이트의 다른 위치로 흘러가지 않도록 플레이트를 고정 상태로 유지하였다. 피펫 팁을 사용하여 50 ㎕ 부피의 세포 덩어리를 떠내고, 피펫 팁의 내용물을 24 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰로 옮겼다. 일단 모든 콜로니가 전달되면, G418을 함유하는 완전 배지를 첨가하고, 단리된 클론이 거의 전면생장하도록 증식시켰다.
각각의 웰이 거의 전면생장되었을 때, 이를 칼슘 및 마그네슘 무함유 PBS로 2회 세척하였다. 세포 해리 완충액 0.2 ml를 사용하여 세포를 떼어냈다. 이 세포 현탁액 중 20 ㎕를 새로운 24 웰 플레이트로 옮기고, 완전 배지 2.0 ml를 첨가하여 남아있는 세포를 원래의 24 웰 플레이트의 표면에 다시 부착시켰다. 원래의 플레이트를 100％ 전면생장되도록 인큐베이션하였다. 새로운 플레이트를 이후의 소과 동물 클로닝 과정에 사용되는 적절하게 표적화된 세포의 공급원으로 사용하였다.
원래의 24 웰 플레이트로부터 한 웰이 100％ 전면생장되면, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 1회 세척하였다. PBS를 제거하고, 문헌 [Laird et al., Nucleic Acids Res. 19:4293, 1991]로부터 채택된 세포 용해 완충액으로 교체하였다. 요컨대, 용해 완충액 (200 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), 5 mM EDTA, 0.2％ SDS 및 100 ㎍/ml 프로테이나제 K 함유) 0.2 ml를 웰에 첨가하였다. 3시간 동안 내지 밤새 플레이트를 인큐베이터로 복귀시켰다. 이어서, 점성이 있는 세포 용해물을 미세원심분리 튜브로 옮겼다. 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 미세원심분리에서 10분 동안 회전시킨 후, 상등액을 제거하고, 펠릿을 70％ 에탄올 0.5 ml로 1회 세척하였다. 에탄올을 제거한 후에, DNA 펠릿을 공기-건조시키고, TE 완충액 (1O mM Tris (pH 8) 및 1 mM EDTA) 35 ㎕에 재현탁하였다. 분취액 3 ㎕를 PCR 분석에 사용하였다.
PCR 분석
AAV 입자로 형질도입된 약물 내성 클론으로부터의 DNA 샘플을 PCR 분석을 이용하여 벡터가 적절하게 표적화되었는지에 대하여 스크리닝하였다. 이 스크리닝 전략은 약물 선별 마커를 코딩하는 DNA 내에서 어닐링하는 프라이머 1개와 표적화된 로커스 내에서 AAV 표적화 입자에 존재하는 서열 외부에 어닐링하는 프라이머 1개를 사용하였다. PCR 산물은 AAV 표적화 DNA가 내인성 게놈의 목적하는 위치에 통합된 경우에만 검출되었다.
상기 AAV 입자를 사용한 단일 표적화 실험의 결과를 도 26에 나타내었다. 이 분석 결과에 기초하여, 73개의 독립적인 클론 중 5개의 클론이 적절하게 표적화된 벡터 DNA를 함유하였다.
이 방법은 또한 도 25에 나타낸 AAV 벡터 또는 임의의 다른 적절한 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 필요한 경우, 제2 뮤 중쇄 대립유전자는 이들을 다른 항생제 내성 유전자 (즉, 네오마이신 내성 유전자가 아닌 유전자)를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입시킴으로써 단리된 콜로니에서 돌연변이화될 수 있다. 생성된 동종접합성 녹아웃 세포를 선별하기 위해, 감염된 세포를 상응하는 항생제의 존재하에 배양하였다. 별법으로, 단리된 콜로니를 네오마이신 내성 유전자를 함유하는 AAV 벡터로 형질도입시키고, 고농도의 항생제 (즉, 이종접합성 녹아웃 세포는 사멸시키지만 동종접합성 녹아웃 세포는 사멸시키지 않는 항생제의 농도)의 존재하에 배양하였다.
실시예 8: 통상적인 소과 동물 핵 이식 배아에서의 핵 리프로그래밍 결핍에 대한 증거
통상적인 핵 이식 기술에서는 일반적으로 출생시 생존율이 낮다. 이하에 기재되는 바와 같이, 이러한 비효율성은 적어도 부분적으로는 재구성된 난모세포가, 난모세포의 발생에 있어서 바람직한 유전자의 전사를 촉진시키고 발생에 있어서 바람직하지 못한 유전자의 전사를 저해하도록 공여자 세포 또는 공여자 핵을 리프로그래밍하지 못하기 때문일 수 있다. 실시예 11 및 12에는 본 발명의 방법에서 프리온 유전자에 돌연변이를 갖고 임의로는 이종 Ig 유전자를 갖는 트랜스제닉 유제동물의 생산에 이용할 수 있는 개선된 클로닝 방법을 기재한다.
소과 동물의 착상전 발생 중의 핵막, 핵 매트릭스 및 염색질-매트릭스 계면 성분의 분포
착상전 배아에서 핵막 (B-형 및 A/C-형 라민), 핵 매트릭스 (NuMA) 및 염색질-매트릭스 계면 (AKAP95) 성분의 분포를 측정하기 위해, 시험관내 수정 (IVF)에 의해 소과 동물의 배아를 생산하고, 면역형광 분석에 의해 검사하였다. 종래에 기재된 바와 같이 소과 동물의 시험관내 수정을 수행하였다 [Collas et al., Mol. Reprod. Devel. 34:212-223, 1993]. 요컨대, 단일 숫소로부터의 냉동-해동된 소과 동물 정자를 45-90％ 퍼콜(Percoll) 구배의 맨 위에 깔고 700×g에서 30분 동안 원심분리하였다. 펠릿 중 정자의 농도를 측정하고, 수정시에 최종 농도가 10 6 개 정자/ml가 되도록 정자를 희석하였다. 성숙된지 22시간 후에, 난모세포를 TL HEPES로 3회 세척하고, 수정 배지 480 ㎕ 중에 넣었다. 10 6 개 정자/ml인 정자 현탁액 20 ㎕를 50개의 난모세포에 첨가하였다. 배아-시험된 미네랄 오일 (Sigma) 0.3 ml로 덮힌 배아 배양 배지 0.5 ml 중의 마우스 태아 섬유아세포 단층을 함유하는 4-웰 조직 배양 플레이트에 배아를 넣어 배양하였다. 25 내지 50개의 배아를 각각의 웰에 넣고, 38.5 ℃, 5％ CO 2 공기 분위기에서 인큐베이션하였다. 수정율은 전핵 발생에 의해 측정시 90％ 초과였다.
상기 시험관내 수정된 소과 동물의 배아의 면역형광 분석을 위해, 항-인간 라민 B 항체를 쟝-끌로드 꾸르발랭 박사 (프랑스 파리 CNRS)로부터 얻었였다. 항-라민 A/C 모노클로날 항체는 산타-크루즈 바이오테크놀로지(Santa-Cruz Biotechnology)에서 구입했고, 항-NuMA 항체는 트랜스덕션 래버러토리즈 (Transduction Laboratories)로부터 입수했다. 항-래트 AKAP95 친화도-정제된 토끼 폴리클로날 항체를 업스테이트 바이오테크놀로지스 (Upstate Biotechnologies)로부터 입수했다. 시험관내 수정된 소과 동물 배아를 폴리-L-리신-코팅된 유리 커버글라스상에 올려놓고, 3％ 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 0.1％ 트리톤(Triton) X-100으로 15분 동안 투과가능화하였다 [Collas et al., J. Cell Biol. 135:1715-1725, 1996]. 단백질을 PBS 중 2％ BSA/0.01％ 트윈(Tween) 20 (PBST) 중에서 15분 동안 블로킹하였다. 일차 항체 (항-AKAP95, 항-라민 B, 항-LBR, 항-NuMA, 및 항-라민 A/C) 및 이차 항체를 각각 30분 동안 인큐베이션하고, PBST-BSA 중에 1:100으로 희석하여 사용하였다. DNA를 흐림방지 탑재 매질에 혼입된 획스트(Hoechst) 33342 0.1 ㎍/ml로 대조염색하였다. 샘플을 슬라이드상에 탑재하고 커버글라스를 손톱 광택제로 밀봉하였다. 올림푸스(Olympus) BX60 형광 현미경상에서 면역형광을 관찰하고, JVC CCD 카메라 및 AnalySIS 소프트웨어로 사진을 촬영하였다. 알더스 포토스타일러(Aldus Photostyler) 소프트웨어를 사용하여 화상을 프로세싱하였다. AnalySIS 정량 프로그램을 사용하여 형광 신호를 상대 정량하였다. 데이타를 평균 상대 형광 강도로 나타냈다.
소과 동물 배아의 면역형광 분석은 B-형 라민이 핵 주변부에서 검출되었음을 나타냈다 (도 29A). 그러나, 라민 A/C는 전핵 또는 8-세포기에 검출되지 않았다. 이와 같이 초기 세포기에 라민 A/C가 검출되지 않는 것은 분화된 세포의 마커로 기대된다 [Guilli et al., EMBO J. 6:3795-3799, 1987]. 핵 매트릭스 구조 단백질인 NuMA는 검사한 모든 단계에서 검출되었다 (도 29A). 그러나, 소과 동물의 전핵 단계 배아에서, NuMA 표지는 두 전핵 중 최소인 암컷 전핵 (FPN)에 제한되었다 (도 29A 화살표). 최근 초기 마우스 배아에서 특징이 규명되고 (Bomar et al., 2002 원고 제출됨) 친화도-정제된 항-래트 AKAP95 항체를 사용하여 검출된 AKAP95도 또한 암컷 전핵에 제한된다 (도 29A). 그럼에도 불구하고, AKAP95의 핵내 분포가 이후 발생 단계의 모든 할구의 핵에서 관찰되었다 (도 29A).
면역형광 표지의 특이성은 소과 동물 일차 태아 섬유아세포 및 전핵 단계 시험관내 수정된 배아의 웨스턴 블롯 분석에 의해 입증되었다 (도 29B). 이 분석을 위해, 단백질을 겔당 40 mA에서 10％ SDS-PAGE로 분리하였다. 단백질을 100 V에서 1시간 동안 전달 완충액 (25 mM TrisHCl, pH 8.3, 192 mM 글리신, 20％ 메탄올, 및 0.1％ SDS) 중의 니트로셀룰로스 막상에 전기영동하여 전달하였다. 막을 Tris-완충된 염수 (TBS; 즉, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl 및 25 mM Tris-HCl, pH 8.0)로 10분 동안 세척하고, 5％ 탈지분유를 함유하는 TBST (0.05％ 트윈 20을 함유하는 TBS)로 1시간 동안 블로킹하고, 하기 일차 항체로 1.5시간 동안 인큐베이션하였다: 항-AKAP95 (1:250 희석), 항-라민 B (1:1000), 항-LBR (1:500), 항-NuMA (1:500) 및 항-라민 A/C (1:500). 블롯을 TBST 중에서 10분 동안 2회 세척하고, 양고추냉이 과산화효소(HRP)-접합된 이차 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 TBS 중에서 10분 동안 2회 세척하고, 증강 화학발광 (enhanced chemiluminescence (ECL), Amersham)을 사용하여 현상하였다.
모든 단백질이 그들의 예상된 겉보기 M r 에서 검출되었다: 68 kDa (B-형 라민), 70 및 60 kDa (각각 라민 A 및 C), 약 180 kDa (NuMA) 및 95 kDa (AKAP95). 전체적으로, 이러한 결과는 소과 동물의 착상전 배아가 교차 반응 항체로 검출될 수 있는 핵 구조 단백질을 발현한다는 것을 나타낸다. 특히, 라민 A/C는 소과 동물의 착상전 배아에서 면역학적으로 검출되지 않았다. 라민 A/C가 체세포에서 발현되기 때문에 (도 29B), 이들은 잠재적으로 핵 이식 배아에서 핵의 리프로그래밍에 대한 분자 마커를 구성한다.
핵 이식 소과 동물 배아에서 핵막, NuMa 및 AKAP95의 동태
소과 동물의 통상적인 핵 이식 절차 중의 핵막 및 핵 매트릭스 구조의 동태를 검사하였다. 이러한 구조들은 각각 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95에 대한 항체를 사용하여 조사하였다. 핵 리모델링 중의 상기 마커들의 동태를 측정하기 위해, 기존에 공여자 세포로서 단리된 일차 태아 섬유아세포를 사용하여 소과 동물의 핵 이식 배아를 생산하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 요컨대, PBS 중의 0.08％ 트립신 및 0.02％ EDTA (트립신-EDTA)를 사용하여 트립신 처리함으로써 소과 동물의 태아로부터의 세포를 수확하였다. 세포를 T75 배양 플라스크 (Corning)에서 10％ 소과 동물 태아 혈청 (FBS; Hyclone), 0.15 g/ml 글루타민 (Sigma), 0.003％ β-메르캅토에탄올 (Gibco) 및 항생제-항진균제 (Gibco)로 보충된 α-MEM (Gibco) 중에 시딩하였다. 시딩하고 3일 후에, 세포를 트립신-EDTA로 수확하고 α-MEM/DMSO 중에 냉동시켰다. G1 세포를 종래에 기재된 바와 같이 단리하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 요컨대, 단리하기 24시간 전에, 5.0×10 5 개의 세포를 MEM/FBS 10 ml를 함유하는 T75 플라스크에 플레이팅하였다. 다음날, 플레이트를 PBS로 세척하고, 배양 배지를 1-2시간 동안 교환하고, 플레이트를 볼텍스 (Vortex)상에서 중간 속도로 30-60 초 동안 진탕하였다. 배지를 제거하고, 500×g에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 MEM/FBS 250 ㎕ 중에 재현탁하였다. 세포질 브릿지에 의해 부착된 세포 이중체를 미세 피펫을 사용하여 선별하고, 핵 전달에 사용하였다.
소과 동물 핵 전달은 종래에 기재된 바와 같이 수행하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 시험관내-성숙된 난모세포가 성숙된지 18-20시간 후에 핵을 제거하였다. G1 공여자 세포를 난황주위 공간내에 전달한 후에, 20 μs 동안 2.4 kV/cm의 단일 전기 펄스를 사용하여 이들을 융합하였다 (Electrocell Manipulator 200, Genetronics). 성숙된지 28-30시간 후에 (즉, 난모세포를 난소로부터 수집한 다음 성숙 배지에 넣은지 28-30시간 후, 및 공여자 세포와 융합된지 2시간 이상 경과한 후) 재구성된 난모세포 및 단성생식 대조군을 칼슘 이오노포어 (5 μM) (Cal Biochem)로 4분 동안 활성화시킨 후, ACM 배지 (100 mM NaCl, 3 mM KCl, 0.27 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM 나트륨 락테이트, 0.4 mM 피루베이트, 1 mM L-글루타민, 3 mg/ml BSA, 1％ BME 아미노산 및 1％ MEM 비필수 아미노산) 중의 시클로헥시미드 10 ㎍ 및 사이토칼라신 D (Sigma) 2.5 ㎍으로 5시간 동안 활성화시켰다 [Liu et al., Mol. Reprod. Dev., 49:298-307, 1998]. 활성화 후에, 핵 이식 배아 또는 난모세포 난자를 5회 세척하고, 38.5 ℃, 5％ CO 2 분위기에서 마우스 태아 섬유아세포와 함께 배양하였다.
재구성된 배아를 표준 방법을 이용하여 활성화시키고, 융합시킨지 3시간 후에, 미성숙 염색질 응축 (PCC) 단계의 배아를 파라포름알데히드로 고정시키고, 라민 A/C, 라민 B, NuMA 및 AKAP95에 대한 항체를 사용하여 면역형광법에 의해 분석하였다 (도 30, PCC). 또한, 전핵 (PN) 단계로의 진전이 허용된 핵 이식 배아의 군 (즉, 융합된지 15시간 후의 소과 동물 배아)을 유사하게 분석하였다 (도 30, 핵 이식-PN). 대조군으로서, 본원에 기재된 바와 같이 활성화된 단성생식 난모세포도 또한 전핵 단계에서 검사하였다 (도 30, 단성생식 PN).
예상한 바와 같이, 체세포 공여자 세포 (소과 동물의 태아 섬유아세포, 도 30)는 문헌으로부터 예측되는 분포를 나타내는 모든 마커를 발현하였다. 미성숙 염색질 응축 단계에서, 획스트 33342에 의한 DNA 염색에 의해 뚜렷한 응축 염색체 덩어리가 입증되었다. 라민 A/C 및 B는, 아마 이들의 난자 세포질내에서의 분산의 결과로서, 응축된 염색체상에서 또는 그 주변에서 검출되지 않았다 (도 30, PCC). 몇몇 표지된 NuMA가 검출되었는데, 이 NuMA는 아마 응축된 염색체를 유지하는 방추극체(spindle pole)와 결합하였을 것이다. 반대로, AKAP95는 응축된 (PCC) 염색체에 결합되어 있었다. 이러한 결과는 유사분열 인간 세포에서의 AKAP95 표지를 상기시킨다 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999; Steen et al., J. Cell Biol. 150:1251-1262, 2000]. 전핵 단계에서, 모든 마커가 검출되었다. 라민 A/C는 전핵막에 존재하였다 (도 2, 핵 이식-PN). 이것은 대조군인 단성생식체(parthenote) 전핵의 막 (도 30) 및 수정된 전핵의 막 (도 29A)에서 존재하지 않았던 것과는 대조적이었다. 라민 B는, 대조군 전핵에서와 같이, 핵 이식 전핵에서 검출되었다. 마찬가지로, NuMA 및 AKAP95는 핵인을 제외한 핵 내부에서 검출되었다. NuMA 표지는 대조군인 단성생식 전핵에서보다 핵 이식 전핵에서 일관되게 더 밝았다 (핵 이식 PN 및 단성생식 PN을 비교, 도 30). 총괄하면, 이러한 관찰들은 핵 이식 배아의 전핵이 체세포 핵 마커인 라민 A 및 C를 재조립하여 강한 NuMA 염색을 나타낸다는 것을 나타낸다.
단성생식 배아 및 핵 이식 배아의 전핵에서 AKAP95의 차등 앵커링
A-키나제 앵커링 단백질인 AKAP95는 유사분열 염색체 응축에 관여하는 핵 단백질이다. 핵 이식 후 체세포 핵의 리프로그래밍에 영향을 미치는 또 다른 분자 마커로 사용하기 위해, 태아 섬유아세포으로부터 형성된 소과 동물의 핵 이식 전핵 단계 배아에서 AKAP95의 핵내 앵커링 특성을 규명하였다. 단성생식 배아로부터의 전핵 및 체세포 공여자 세포의 핵에서의 AKAP95의 앵커링도 또한 검사하였다.
전핵 배아에서 AKAP95의 핵내 앵커링은, 배아를 실온에서 30분 동안 0.1％ 트리톤 X-100, 1 mg/ml DNAse I, 및 100 또는 300 mM의 NaCl로 추출하여 원위치 검사하였다. 상기 주지한 바와 같이, 수컷 전핵은 AKAP95를 갖지 않았다. 반대로, 핵 이식 배아의 전핵 및 소과 동물의 공여자 핵에서는 상당한 양의 AKAP95 및 DNA가 DNAse I 및 300 mM NaCl에 내성이 있었다 (도 31). B-형 라민이 단성생식체 또는 핵 이식 전핵에서 DNAse I 및 300 mM NaCl에 의해 추출되지 않은 것은 (도 31), AKAP95 및 DNA 분포의 변화가 핵 구조의 총체적 변화로 인한 것이 아님을 시사한다. 이러한 데이타는, 체세포 핵에서와 같이, AKAP95가 소과 동물의 단성생식 전핵에서보다 핵 이식 전핵에서 핵내 구조에 더 단단히 앵커링되어 있음을 나타낸다. 이러한 결합이 DNA의 조직화에 제약을 주는지 또는 핵 이식 배아에서의 변화된 게놈 조직화로 인한 것인지는 단정할 수 없다. DNAse I-내성 DNA는 전사되지 않으므로, 핵 이식 후의 AKAP95 앵커링의 불완전한 리모델링이 발생학적으로 중요한 유전자들의 발현을 감소시키는 것으로 보인다.
핵 이식된 소과 동물 배아에서 라민 A/C의 전사 조절 오류
놀랍게도, 소과 동물의 핵 이식 배아의 전핵 주변부에서 라민 A/C가 재조립되는 반면, 이 체세포-특이적 마커가 시험관내 수정된 단성생식 전핵에는 존재하지 않는다는 것이 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 라민 A/C의 재조립이 (i) 미성숙 염색질 응축 단계에서 해체된 체세포 라민의 재표적화 (도 30)에 의한 것인지, (ii) 모계 라민 A/C mRNA 수집물로부터의 라민의 해독 및 조립에 의한 것인지, 또는 (iii) 핵 이식 전핵에서 체세포 라민 A (LMNA) 유전자의 새로운 전사에 의한 것인지 조사하였다.
상기 가능성들을 구별하기 위해, 본원에 기재된 "통상적인" 핵 이식 절차와 같이 핵을 이식한 후에 재구성된 배아를 단백질 합성 저해제인 시클로헥시미드 (CHX)로 활성화시키거나, 또는 핵을 이식한 후에 새로운 전사를 저해하는 RNA 중합효소 II (Pol II) 저해제인 악티노마이신 D (ActD)의 존재하에서 활성화시켜 소과 동물의 핵 이식 배아를 생산하였다. 시클로헥시미드 중에서 소과 동물의 핵 이식 배아를 배양하기 위해, 난모세포를 시클로헥시미드 (CHX) 중에서 14시간 동안 인큐베이션한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 핵 전달 후에 난모세포를 활성화시켰다. 활성화시킨지 14시간 후에, 난모세포를 5회 세척하고, 15 ㎍/ml 획스트 33342 (Sigma)를 함유하는 ACM 배양 배지에 1시간 동안 두었다. 인큐베이션한 후에, 형광 현미경으로 전핵 발생을 관찰하였다. 이어서, 전핵 배아를 PBS 중의 3％ 파라포름알데히드에서 고정하고, 세척하고, 슬라이드에 탑재하였다. 악티노마이신 D 중에서 소과 동물의 핵 이식 난모세포를 배양하기 위해, 시클로헥시미드 인큐베이션 단계에 5 ㎍/ml 악티노마이신 D (ActD)를 첨가한 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 핵을 전달한 후에 난모세포를 활성화시켰다. 5시간 후에, 난자를 5회 세척하고, 5 ㎍/ml 악티노마이신 D를 함유하는 ACM 배양 배지에 두었다. 활성화시킨지 14시간 후에, 난자를 5회 세척하고, 15 ㎍/ml 획스트 33342 (Sigma)를 함유하는 ACM 배양 배지에 1시간 동안 두었다. 인큐베이션한 후에, 형광 현미경으로 전핵 발생을 관찰하였다. 전핵 단계 배아를 PBS 중의 3％ 파라포름알데히드에서 고정하고, 세척하고, 슬라이드에 탑재하였다.
핵 이식 전핵 주변의 라민 B 조립은 단백질 또는 RNA의 합성 저해에 영향을 받지 않았다. 이러한 결과는 라민 B가 이전에 해체된 체세포 수집물 및(또는) 난모세포 세포질 중의 라민 B의 대형 수집물로부터 재조립되었음을 나타낸다. 핵 이식 전핵에서 검출된 라민 A/C는 (도 30) 시클로헥시미드로 활성화시킨 후에 재형성된 핵에는 없었다. 이러한 결과는 라민 A/C의 조립이 새로운 단백질 합성을 필요로 하고 이 라민들이 공여자 핵 주입 또는 세포 융합에 의해 난모세포에 도입된 해체된 체세포 수집물로부터 재표적화되는 것이 아님을 나타낸다. 또한, 라민 A/C는 배아가 악티노마이신 D의 존재하에서 활성화된 때에는 재조립되지 않았다. 이러한 결과는 핵 이식 전핵에서의 라민 A/C의 재조립이 재구성된 전핵에서 LMNA 유전자의 새로운 전사에 의해 초래된 것임을 나타낸다. 핵 이식 전핵에서 검출된 NuMA는 시클로헥시미드로 활성화시킨 핵 이식 배아의 전핵에서는 재조립되지 않았으나, 악티노마이신 D-처리된 핵 이식 배아의 전핵에서는 희미하게 검출되었다. 이러한 발견은 핵 이식 전핵에서의 NuMA의 재조립이, 적어도 부분적으로는 모계 NuMA mRNA로부터 일어나는 새로운 해독을 필요로 함을 강력히 시사한다. 항-NuMA 표지가 대조군인 비처리 핵 이식 배아보다 악티노마이신 D-처리된 핵 이식 배아의 전핵에서 약하다는 일관된 관찰 (도 32에서 b' 및 b'''를 비교)은 핵 이식 전핵에서의 NuMA 조립의 일부가 전핵 단계에서 NuMA 유전자의 새로운 전사로 인한 것임을 시사한다.
전체적으로, 상기 결과들은 LMNA 유전자가 핵 이식 후에 핵 리모델링에서 불활성화되지 않음을 나타낸다. 유사하게, NuMA 유전자는 명백히 전핵 핵 이식 배아에서 활성 상태로 남아 있다. 상기 유전자의 일시적인 불활성화는, 염색질의 고도로 응축된 성질로부터 예상되는 바와 같이, 미성숙 염색질 응축 중에 발생하는 것으로 보인다 (도 30). 이러한 결과는 본원에 기재된 조건하에서 생산된 핵 이식 배아에서의 불완전한 핵 리프로그래밍을 뚜렷이 예시하는 것이다. AKAP95에 대해 상기 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 핵 이식 전핵에서 라민 A/C의 존속이 유전자 발현, 예컨대 발생학적으로 중요한 유전자의 발현에 영향을 미친다고 제안한다. 종래에 보고된 라민 A 및 C와 염색질 단백질 및 DNA의 상호작용, 및 이 라민들과 전사 인자의 연관도 또한 이 가설을 지지한다.
실시예 9: 통상적인 소과 동물의 핵 이식 배아에서 예시적인 핵 리프로그래밍 결핍
자연 발생 배아 및 통상적인 핵 전달 배아 사이의 예시적인 차이도 또한 이하에 기재하였다. 이러한 차이에는 분화된 세포-특이적 A-형 핵 라민의 전핵 조립, 증강된 전핵 NuMA 및 TATA 결합 단백질의 농도, 및 디터전트, DNAse 및 염을 사용한 추출에 대한 핵 매트릭스-염색질 계면 성분 AKAP95 및 DNA의 증가된 민감성의 차이가 포함된다.
이러한 연구를 위해, 소과 동물의 태아 섬유아세포 세포주를 종래에 기재된 바와 같이 확립하였다 [Kasinathan et al., Nat. Biotechnol. 19:1176-1178, 2001 and Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. G1-기 섬유아세포 이중체를 종래에 기재된 진탕 분리 방법을 이용하여 배양물로부터 단리하였다 [Kasinathan et al., Nat. Biotechnol. 19:1176-1178, 2001]. 종래에 기재된 바와 같이 시험관내-성숙된 난모세포로 시험관내 수정을 수행하였다 [Collas et al., Mol. Reprod. Dev. 34:224-231, 1993]. 핵 이식 (NT) 및 난모세포 활성화를 위해, 종래에 보고된 바와 같이 성숙 후 약 20시간 (hpm)에 G1-기 공여자 세포를 사용하여 핵 이식을 수행하였다 [Kasinathan et al., Nat. Biotechnol. 19:1176-1178, 2001 and Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 재구성된 배아를 28-30 hpm (T=0)에 5 μM 칼슘 이오노포어로 4분 동안 활성화시킨 후, 10 ㎍/ml CHX 및 2.5 ㎍/ml 사이토칼라신 D로 5시간 동안 활성화시켰다. 배아를 세척하고, 마우스 태아 섬유아세포와 함께 배양하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 재구성된 배아를 CHX 중에서 배양하는 경우, 난모세포를 상기와 같이 활성화시키고 2.5 ㎍/ml CHX와 함께 9시간 동안 더 배양하였다 (총 CHX 중에서 14시간). 배아를 철저히 세척하고, 기재된 바와 같이 배양하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 재구성된 배아를 ActD에 노출시키는 경우, 5시간의 CHX 인큐베이션 단계에 5 ㎍/ml ActD를 첨가한 것을 제외하고는 상기와 같이 난모세포를 활성화시켰다.
면역학적 분석을 위해, 세포, 난모세포, 배아, 핵 (실시예 14), 및 염색질 덩어리들 (실시예 14)을 폴리-L-리신-코팅된 커버글라스상에 올려놓고, 3％ 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 0.1％ 트리톤 X-100으로 15분 동안 투과가능화하였다. 단백질을 PBS/2％ BSA/0.01％ 트윈 20으로 블로킹하였다. 일차 및 이차 항체 (1:100 희석)를 각각 30분 동안 인큐베이션하였다. 구체적으로는, 인간 라민 B의 펩티드에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 사용하였다 [Chaudhary et al., J. Cell Biol. 122: 295-306, 1993]. 산타-크루즈 바이오테크놀로지 (Santa-Cruz Biotechnology)에서 입수한 염소 항-라민 B 폴리클로날 항체, 항-라민 A/C 모노클로날 항체 및 항-TBP 항체도 또한 사용하였다. 항-NuMA 모노클로날 항체는 트랜스덕션 래버러토리즈 (Transduction Laboratories)로부터 입수했고, 항-래트 AKAP95 친화도-정제된 폴리클로날 항체는 업스테이트 바이오테크놀로지스 (Upstate Biotechnologies)로부터 입수했다. DNA를 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 대조염색하였다. JVC CCD 카메라로 사진을 촬영하고, AnalySIS 소프트웨어를 사용하여 면역형광 강도를 정량하였다. 데이타는 3배수 이상의 실험에서 대조군에 대한 평균±SD의 형광 강도로 나타냈다. 원위치 추출을 위해, 면역형광 분석 전에 커버글라스상에 놓인 배아 및 세포를 0.1％ 트리톤 X-100, 1 mg/ml DNAse I 및 Tris-HCl 중의 300 mM NaCl (pH 7.2)과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이뮤노블롯팅을 위해, 100개의 배아를 20 ㎕ SDS 샘플 완충액에 용해시키고, 단백질을 10％ SDS-PAGE로 분리하고, 하기 항체로 분석하였다: 항-라민 B, 1:1,000; 항-라민 A/C, 1:250; 항-NuMA, 1:500; 항-AKAP95, 1:250.
상기 면역학적 분석에 기초하여, NT에 통상적으로 사용되는 소과 동물의 태아 섬유아세포에서 A/C- 및 B-형 라민, NuMA 및 AKAP95의 분포를 규명하였다 (도 40). 시험관내 생산된 소과 동물의 착상전 배아에서, 전핵 (PN) 단계만큼 일찍 핵 주변부에서 라민 B가 검출되었다 (도 40). 분화된 세포의 마커로부터 예상한 바와 같이, 라민 A/C는 없었다. NuMA 및 AKAP95는 전핵 단계에서 암컷 전핵에 제한되었으나, 이후 단계에서는 모든 핵에서 나타났다. 면역형광 데이타의 특이성을 이뮤노블롯상에서 검증하였다 (도 40).
전기융합에 의한 핵제거된 난모세포로의 소과 동물 섬유아세포의 이식과 관련된 형태적 핵 리모델링 과정에서 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95의 동태를 검사하였다 [Kasinathan et al. Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 공여자 핵은 융합 3시간 이내에 미성숙 염색질 응축 (PCC)을 거쳤다 (도 41A). 핵 라민 및 NuMA는 난모세포 세포질내에 재분포되었고, PCC 염색체에는 없었다 (도 41A). AKAP95는 유사분열 세포처럼 PCC 염색체와 결합하였다. 수용자 난모세포의 활성화 처리를 시작한지 14시간 후에, NT 배아는 완전히 발달된 전핵을 보였다 (도 41A, NT PN). 그러나, 단성생식 또는 수정된 배아의 전핵과는 반대로, 본질적으로 모든 NT 전핵이 체세포 공여자 세포의 두가지 특징인 강력한 라민 A/C 및 NuMA 면역반응성을 나타냈다 (도 41A).
10 ㎍/ml 단백질 합성 저해제 시클로헥시미드 (CHX) 또는 5 ㎍/ml RNA 중합효소 (Pol) II 저해제 악티노마이신 D (ActD) (둘 다 전핵 형성과 상용성)의 존재하에서의 수용자 난모세포 활성화는 전핵 라민 A/C 조립을 저해하였다 (도 41B 및 41C). 이러한 결과는 상기 체세포 라민의 조립이 체세포 라민 A (LMNA) 유전자의 전사에 의한 것임을 나타낸다. 라민 B의 조립이 CHX 또는 ActD에 의해 교란되지 않는 것은 이것이 해체된 체세포 수집물 및(또는) B-형 라민의 모계 수집물로부터 재표적화된 것임을 나타낸다 (도 41B 및 41C). 본질적으로 CHX 노출 후에는 NuMA가 검출되지 않았으나, ActD 처리 후에는 NT 전핵에서 40％의 NuMA 면역반응성이 검출되었다 (도 41B 및 41C). 이러한 결과는 NuMA가 모계 mRNA 및 새로운 전사로부터의 해독의 결과로 조립됨을 시사한다. 라민 A/C 및 NuMA가 NT 전핵에서 비정상적으로 전사되기 때문에, 이 단백질들은 핵 전달 방법이 공여자 유전 물질을 리프로그래밍하는 능력을 측정하는 마커로 사용될 수 있다.
실시예 8에서 논의한 바와 같이, 핵 매트릭스-염색질 계면의 구조적 다가 단백질이며 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999] 저아세틸화 염색질에 풍부한 AKAP95의 핵내 앵커링 특성은, 공여자 유전 물질의 리프로그래밍에 대한 마커로 사용될 수도 있다. AKAP95는 PCC 염색체상의 체세포 공여자 핵에서 검출되고 단성생식체 (도 41A) 및 PN 배아 (도 40B)와 유사한 표지 강도를 갖는 NT 전핵에서 검출된 것으로 조사된 유일한 마커였다. NT 전핵과 AKAP95의 결합은 단백질 또는 RNA 합성의 저해에 의해 유지되었다. 따라서, NT 배아에서 PN AKAP95의 주요 분획은 체세포 기원이었다. AKAP95의 앵커링은 NT 배아, 단성생식체 및 공여자 섬유아세포를 0.1％ 트리톤 X-100, 1 mg/ml DNAse I 및 300 mM NaCl로 추출하여 검사하였다. 단성생식체에서는, 약 90％의 AKAP95 및 DNA가 추출되었으나, NT 전핵에서는 AKAP95의 35％가 내성을 가졌다 (도 41D). DNAse I 및 NaCl에 대한 AKAP95 및 DNA의 민감성은 섬유아세포 핵에서와 유사했다 (도 41D). 라민 B가 상기 조건에서 추출되지 않은 것은, AKAP95 및 DNA의 추출능의 차이가 핵 구조의 총체적 변화에 의한 것이 아님을 나타낸다. 상기 결과는 NT 전핵의 특징이 AKAP95의 단단한 앵커링 및 DNAse I에 대한 DNA의 제한된 접근가능성임을 암시한다. 따라서, 체세포 NT에 의해 생산된 전핵은 공여자 핵의 불완전한 형태 리모델링 및(또는) 체세포 유전자들의 전사 조절 오류의 결과로서 구조적 이상을 나타내는 것으로 보인다.
실시예 10: 통상적인 소과 동물 핵 이식 배아에서의 예시적인 핵 리프로그래밍 결핍
실시예 9에 기재된 바와 같이, 핵 이식 (NT) 배아에서의 발현 패턴을 시험관내-생산된 (IVP) 착상전 배아의 발현 패턴과 비교하였다. 상기 비교를 위해, 시험관내 수정을 수행하고, 종래에 기재된 바와 같이 배아를 배양하였다 [Collas et al., Mol. Reprod. Dev. 34:224-231, 1993 and Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. NT는 공여자 소과 동물의 태아 섬유아세포를 핵제거된 난모세포에 융합시켜 수행하였다 [Kasinathan et al., Nat. Biotechnol. 19:1176-1178, 2001 and Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 성숙 후 28-30시간 (hpm)에 수용자 난모세포를 5 μM 칼슘 이오노포어로 4분 동안 활성화시킨 후, 10 ㎍/ml CHX 및 2.5 ㎍/ml 사이토칼라신 D로 5시간 동안 활성화시키고, 세척하였다. 배아를 마우스 태아 섬유아세포와 함께 배양하였다 [Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. CHX 처리를 위해, 난모세포를 상기와 같이 활성화시키고, 배양하기 전에 배아를 2.5 ㎍/ml CHX로 9시간 동안 더 배양하였다. ActD 처리를 위해, 5시간의 CHX 인큐베이션 단계에 5 ㎍/ml ActD를 첨가한 것을 제외하고는 상기와 같이 난모세포를 활성화시키고, 배양하기 전에 배아를 5 ㎍/ml ActD로 9시간 동안 더 배양하였다. NT 배아를 포배 단계로 시험관내 배양하고, 수용자 암컷마다 2개의 배아를 전달하였다. 초음파촬영술로 임신 여부를 모니터링하고, C-절개를 수행하였다. 송아지를 생후 24시간 이내에 수의사에 의해 평가하였다.
NT 및 IVP 배아에서 단백질 수준의 분석을 위해, 산타-크루즈 바이오테크놀로지 (Santa-Cruz Biotechnology)에서 입수한 항-라민 B 폴리클로날 항체, 항-라민 A/C 모노클로날 항체, 및 항-TBP 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하였다. 항-AKAP95 항체는 업스테이트 바이오테크놀로지스 (Upstate Biotechnologies)로부터 입수하였다. 면역형광 분석은 기재된 바와 같이 수행하였다 [Bomar et al., J. Cell Sci. 115:2931-2940, 2002]. 요컨대, 세포 및 배아를 폴리-L-리신-코팅된 커버글라스상에 올려놓고, 3％ 파라포름알데히드로 15분 동안 고정하고, 0.1％ 트리톤 X-100으로 15분 동안 투과가능화하고, 단백질을 PBS/2％ BSA/0.01％ 트윈 20으로 블로킹하였다. 샘플을 일차 및 이차 항체 (1:100 희석)와 함께 각각 30분 동안 인큐베이션하였다. DNA를 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 대조염색하였다. JVC CCD 카메라로 사진을 촬영하고, AnalySIS 소프트웨어를 사용하여 면역형광 강도를 정량하였다. 언급된 경우, 면역형광 분석 전에 샘플들을 커버글라스상에서 0.1％ 트리톤 X-100, 1 mg/ml DNAse I 및 Tris-HCl 중의 300 mM NaCl (pH 7.2)과 함께 15분 동안 인큐베이션하였다. 이뮤노블롯팅을 위해, 단백질 샘플 (30 ㎍)을 10％ SDS-PAGE로 분리하고, 니트로셀룰로스상에 블롯팅하고, 언급된 항체로 탐침하였다.
핵 이식 배아에서 공여자 핵의 동태
소과 동물의 핵 이식 (NT) 과정 중의 체세포 핵의 동태를 조사하기 위해, 핵막의 두가지 구조 성분, 즉 어디에서나 발현되는 B-형 라민 (라민 B로 지칭함) 및 분화된 세포-특이적 A-형 라민 (라민 A/C)의 분포를 검사하였다 [Gruenbaum et al., J. Struct. Biol. 129:313-323, 2000]. 핵 라민은 핵막을 염색질에 앵커링시키고 시험관내 (전)핵의 재구성 후에 핵의 팽창을 증진시키는 것으로 제안되었다. 라민은 또한 세포의 생존에 필수적이어서, B-형 라민의 조립 실패는 세포 사멸을 초래하는 것으로 밝혀졌다. 전사 기구의 마커로서, 실질적으로 모든 유전자에 대한 전사 인자인 TATA-결합 단백질 (TBP)의 동태를 분석하였다. 소과 동물의 태아 섬유아세포 및 시험관내-생성된 (IVP) 착상전 배아에서 라민 B의 핵주위 분포 및 TBP와 DNA의 공동 국소화는 다른 종에서의 관찰과 일치하였다 [Holy et al., Dev. Biol. 168:464-478, 1995; Houliston et al., Development 102:271-278, 1988; and Worrad et al., Development 120:2347-2357, 1994] (도 46A). 라민 A/C는 분화된 세포의 마커로부터 예상되는 바와 같이 착상전 발생 동안 검출되지 않았다 (도 46A). 면역형광 표지의 특이성은 이뮤노블롯에서 검증되었다 (도 46B).
핵제거된 난모세포로 섬유아세포 핵을 이식한 후에, 라민 A/C 및 B는 둘 다 미성숙의 응축된 염색체 (PCC; 융합 후 3시간)로부터 해체된 반면, TBP는 염색체와 결합한 채로 남아있었다 (도 46C, PCC). 수용자 난모세포의 활성화를 개시한지 14시간 후에, 모든 NT 배아가 핵주위 라민 B 표지 및 DNA와 공동 국소화된 TBP를 갖는 완전히 발달된 전핵을 함유하였다. 그러나, IVP 배아와는 반대로, NT 배아의 95-99％가 전핵 단계만큼 일찍 라민 A/C 발현을 나타냈고 (도 46C), 이 발현은 초기 발생 동안 지속되었다 (이하 참조). NT 및 IVP 배아의 전핵에서 면역표지된 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 상대량을 DNA에 대한 이차 항체 형광 강도 (획스트 33342)의 비를 측정함으로써, 검사한 핵에서의 DNA 함량 (반수체 대 이배체)을 정량하였다. 라민 B의 상대량은 NT 및 IVP 배아의 전핵과 유사한 반면, 라민 A/C 및 TBP의 상대량은 IVP 배아의 수컷 (MPN) 또는 암컷 (FPN) 전핵에서보다 NT 전핵에서 더 높았다 (도 46D).
NT 배아의 전핵에서의 TBP, DNA 및 A-형 라민
NT 전핵내의 다량의 TBP는 디터전트 (1％ 트리톤 X-100), 뉴클레아제 (1 mg/ml DNAse I) 및 염 (0.3 M NaCl)의 조합에 의한 원위치 추출에 대한 더 큰 내성과 관련이 있었다. 비-추출된 대조군에 대한 추출된 배아에서의 면역형광 표지 강도의 정량에 의하면, 약 35％의 TBP가 IVP 배아의 수컷 (MPN) 또는 암컷 (FPN) 전핵내에 비추출된 상태로 남아있었다. 그러나, NT 전핵의 TBP는 섬유아세포 핵에서와 같이 추출물에 대해 강력한 내성을 나타냈다 (도 47A). 유사하게, NT 전핵의 DNA는 IVP 배아의 전핵에 비해 상기 조건하에서 추출에 대해 4.5배 증가된 내성을 나타으며 (도 47A, DNA), 이는 더욱 밀집된 염색질 조직화를 시사한다.
NT 배아의 전핵에서 라민 B, 라민 A/C 및 TBP의 기원을 결정하기 위해, 본원에 기재된 바와 같이 RNA 중합효소 (Pol) II 저해제인 악티노마이신 D (ActD; 5 ㎍/ml)의 존재하에서, 또는 단백질 합성 저해제인 시클로헥시미드 (CHX; 10 ㎍/ml)에 의해 수용자 난모세포를 활성화시켰다 [Knott et al., Biol. Reprod. 66:1095-1103, 2002]. 라민 A/C, 라민 B 및 TBP의 조립을 면역형광으로 표지된 전핵 배아의 밀도측정 분석에 의해 검사하였다. 상기 저해제 둘 다가 전핵 라민 A/C의 조립을 방지한 것 (도 47B 및 48C)은 NT 배아에서 상기 체세포 라민의 조립이 전핵 단계에서 라민 A 유전자의 전사에 의한 것임을 시사한다. 라민 B의 조립이 CHX 또는 ActD 처리에 의해 교란되지 않은 것 (도 47B 및 47C)은 라민 B가 NT 이후에 난모세포 세포질내에 가용화된 체세포 라민 및(또는) 라민의 모계 수집물로부터 조립되었음을 시사한다. 유사한 양의 TBP가 비처리 배아에서 또는 RNA 또는 단백질 합성의 저해 후에 검출되었다 (도 47B 및 47C). PCC 도중에 TBP가 응축된 염색체와 결합하고, 중기 II 난모세포 세포질은 검출가능한 TBP가 없기 때문에, 체세포 기원의 TBP는 아마 NT 도중에 공여자 게놈과 결합한 채로 남아있을 것이다. 따라서, A-형 라민의 발현에 추가하여, NT 배아의 전핵에서는 더 많은 양의 TBP 및 증강된 TBP의 핵내 앵커링을 나타낼 것이다.
실시예 11: 포유동물을 클로닝하기 위한 리프로그래밍된 공여자 염색질 덩어리의 사용
실시예 8 내지 10에서 입증된 통상적인 핵 전달 배아에서 불완전한 리프로그래밍의 문제를 극복하기 위해, 핵 전달 전에 염색질을 더 효율적으로 리프로그래밍하기 위한 새로운 방법을 개발하였다 (2001년 12월 21일자로 출원된 PCT/US01/50406). 이들 방법은 핵막 용해 및 가능한 염색질 응축을 초래하는 리프로그래밍 배지 (예컨대, 세포 추출물) 중에서 공여자 세포로부터의 핵 (예컨대, 이종 항체를 코딩하는 핵)을 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이러한 핵막 붕괴 및 염색질 응축은 염색체에 부착된 전사 조절 단백질을 방출시키고, 그렇지 않은 경우에는 난모세포, 배아 또는 태아 발생에 바람직하지 않은 유전자의 전사를 촉진시킬 것이다. 또한, 리프로그래밍 배지로부터의 조절 단백질은 염색질 덩어리를 결합시켜 발생에 바람직한 유전자의 전사를 촉진시킬 수 있다.
프리온 유전자에 돌연변이를 갖고 임의로는 이종 Ig 유전자를 갖는 유제동물을 생산하기 위해, 리프로그래밍 동안 또는 전후에 프리온 유전자의 하나 이상의 대립유전자를 돌연변이화시키거나 임의로는 이종 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 삽입함으로써, 공여자 핵 또는 염색질 덩어리를 변형시킬 수 있다. 필요에 따라, 추가의 클로닝된 자손을 생산하기 위한 제2 라운드의 핵 전달에서 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포를 사용할 수도 있다. 또한, 최초 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포를 동결시켜, 추가의 클로닝된 유제동물의 생산을 위한 공여자 세포의 공급원으로서 사용되는 세포주를 형성시킬 수 있다.
클로닝에 사용하기 위한 공여자 핵의 벌크 제조
수백만의 핵들 만큼 많은 핵을 배양물 중의 동기화되거나 또는 동기화되지 않은 세포 군집으로부터 단리할 수 있다. 세포 군집을 자연적으로 또는 화학적으로 동기화할 수 있다. 바람직하게는, 군집 중의 40％, 60％, 80％, 90％ 또는 100％의 세포를 G 0 또는 G 1 단계에 정체시킨다. 이를 달성하기 위해 세포를, 예를 들면 낮은 농도의 혈청, 예컨대 5％, 2％, 또는 0％의 혈청에서 1, 2 또는 3 일 이상 동안 인큐베이션하여 G 0 단계에서의 세포의 비율을 증가시킬 수 있다. G 1 의 세포를 동기화하기 위해 세포를 성장시켜 부착된 세포로서 전면생장시키고, 이어서 상기 기재한 바와 같이 노코다졸 0.5-1 ㎍/ml (미주리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼스 (Sigma Chemicals)) 중에서 17-20시간 동안 인큐베이션할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999] 및 그의 참고문헌 참조). 한 손으로 플라스크를 반복적으로 가볍게 쳐서 부착된 세포를 함유하는 플라스크를 격렬하게 진탕함으로써 유사분열 세포 및 G 1 단계 이중체의 분리를 유발한다. G 1 단계 이중체는 여전히 얇은 브릿지에 의해 연결된 분열 과정의 말기에서 연장된 세포의 쌍들이다. 분리된 G 1 단계 이중체를 이 특유한 이중체 구조에 기초하여 배지로부터 단리할 수 있다. G 1 단계 이중체는 부착된 채 유지되거나 또는 단리 후에 2개의 개별 세포로 분열될 수 있다.
표준 방법을 이용하여 인산염 완충 염수 (PBS)에서 동기화되거나 또는 동기화되지 않은 세포를 수확하고, 수회의 세척을 수행하여 세포를 원 배지로부터 저장성 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.5, 2 mM MgCl 2 , 25 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μM 아프로티닌, 10 μM 류펩틴, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 대두 트립신 저해제 및 100 μM PMSF) 내로 옮겼다. 예를 들면, 세포를 PBS 50 ml로 세척하고, 10분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하여 펠릿화할 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, PBS 상등액을 경사분리하고, 펠릿화된 세포를 PBS 50 ml에 재현탁하고, 원심분리하였다. 이 원심분리 후에, 펠릿화된 세포를 20-50 부피의 빙냉 저장성 완충액에 재현탁하고, 10분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하였다. 상등액을 다시 제거하고, 대략 20 부피의 저장성 완충액을 세포 펠릿에 첨가하였다. 세포를 조심스럽게 이 완충액에 재현탁하고, 1시간 이상 동안 빙상에서 인큐베이션하여 세포를 점진적으로 팽윤시켰다.
세포로부터 핵을 단리하기 위해 표준 방법을 이용하여 세포를 용해시켰다. 예를 들면, 세포 현탁액 2-5 ml를 유리 균질화기로 옮기고, 최초 10-20 스트로크의 딱 맞는 막자를 이용하여 다운스 (Dounce) 균질화시켰다. 별법으로는, 전동 믹서 (예컨대, 울트라투락스 (Ultraturrax))를 사용하여 세포 현탁액을 균질화시켰다. 필요에 따라, 40배 확대의 위상차 현미경을 이용하여 세포 용해를 모니터링할 수 있다. 이 균질화 동안, 핵은 손상되지 않은 채 유지되어야 하고, 원래 부착된 세포질 성분, 예컨대 소포, 세포소기관, 및 단백질의 대부분, 바람직하게는 모두가 핵으로부터 방출되어야 한다. 필요에 따라, 1-20 ㎍/ml의 세포골격 저해제, 사이토칼라신 B 또는 사이토칼라신 D를 상술된 저장성 완충액에 첨가하여 이 과정을 촉진할 수 있다. 세포의 용해 및 핵으로부터의 세포질 성분의 방출에 요구되는 만큼 균질화를 지속하였다. 일부 세포 유형에 대해서는, 100 또는 150 이상의 스트로크가 요구될 수 있다. 용해물을 이어서 빙상의 15 ml 원뿔형 튜브 내로 옮기고, 세포 용해 절차를 팽윤된 세포의 남은 현탁액으로 반복하였다. 저장성 완충액으로 제조한 2 M 원액으로부터의 수크로스를 세포 용해물에 첨가하여 (예컨대, 1/8 부피의 2 M 원액을 용해물에 첨가함) 최종 농도가 250 mM인 수크로스가 되게 하였다. 이 용액을 뒤집어서 혼합하고, 10 내지 40분 동안 4 ℃ 및 400 xg의 스윙 아웃 로터 (swing out rotor)로 원심분리하여 핵을 펠릿화시켰다. 상등액을 이어서 제거하고, 펠릿화된 핵을 10-20 부피의 핵 완충액 (10 mM HEPES, pH 7.5, 2 mM MgCl 2 , 250 mM 수크로스, 25 mM KCl, 1 mM DTT, 10 μM 아프로티닌, 10 μM 류펩틴, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 대두 트립신 저해제 및 100 μM PMSF)에 재현탁하였다. 상기 기재한 바와 같이 핵을 침강시키고, 1-2 부피의 핵 완충액에 재현탁하였다. 새롭게 단리한 핵을 하기 기재하는 바와 같이 시험관내 리프로그래밍 및 핵 전달에 즉시 사용하거나, 또는 이후에 사용하기 위해 저장할 수 있다. 저장을 위해, 핵을 핵 완충액에 대략 10 6 /ml의 농도로 희석하였다. 글리세롤 (2.4 부피의 100％ 글리세롤)을 첨가하고, 완만하게 피펫팅하여 잘 혼합하였다. 현탁액을 빙상의 1.5 ml 튜브에 100-500 ㎕ 부피로 분취하고, 메탄올-드라이 아이스 욕조에서 즉시 동결시키고, -80 ℃에 저장하였다. 사용하기 전에, 핵의 분취물을 빙상에서 또는 실온에서 해동시켰다. 1 부피의 빙냉 핵 완충액을 첨가하고, 용액을 15분 동안 1,000 xg의 스윙 아웃 로터에서 원심분리하였다. 상기 기재한 바와 같이 펠릿화된 핵을 100-500 ㎕의 핵 완충액에 재현탁하고, 원심분리하였다. 펠릿화된 핵을 이어서 최소 부피의 핵 완충액에 재현탁하고, 사용 때까지 빙상에 저장하였다.
공여자 유전 물질의 리프로그래밍에 사용하기 위한 유사분열 추출물 또는 배지의 제조
유사분열 추출물을 제조하기 위해, 체세포주 (예컨대, 섬유아세포)를 노코다졸 0.5-1 ㎍/ml에서 17-20시간 동안 인큐베이션함으로써 유사분열 단계를 동기화하고 (예컨대, 문헌 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999] 및 그의 참고문헌), 상기 기재한 바와 같이 유사분열 세포를 격렬하게 진탕함으로써 분리하였다. 분리된 G 1 단계 이중체를 제거하거나 또는 분리된 세포의 대부분 (전형적으로 80％ 이상)을 구성하는 유사분열 세포로 남게 할 수 있다. 수확된 분리 세포를 10 ml 원뿔형 튜브 내에서 10분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하였다. 몇몇의 세포 펠릿을 취합하고, 총 부피 50 ml의 냉각 PBS에 재현탁하고, 10분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하였다. 이 PBS 세척 단계를 반복하였다. 세포 펠릿을 대략 20 부피의 빙냉 세포 용해 완충액 (20 mM HEPES, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 μM 아프로티닌, 10 μM 류펩틴, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 대두 트립신 저해제, 100 μM PMSF 및 임의로 사이토칼라신 B 20 ㎍/ml)에 재현탁하고, 세포를 10분 동안 4 ℃ 및 800 xg에서 원심분리함으로써 침강시켰다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 단지 1 부피의 세포 용해 완충액에 조심스럽게 재현탁하였다. 세포를 빙상에서 1시간 동안 인큐베이션하여 세포를 팽윤시켰다. 팁 초음파분해기를 사용하는 초음파분해 또는 유리 막자사발 및 막자를 사용하는 다운스 균질화에 의해 세포를 용해시켰다. 90％ 이상의 세포 및 핵이 용해될 때까지 세포 용해를 수행하며, 이를 위상차 현미경을 이용하여 평가할 수 있다. 90％ 이상의 세포 및 핵을 용해하는 데 요구되는 초음파분해 시간은 추출물을 제조하기 위해 사용되는 세포의 유형에 따라 달라질 수 있다.
세포 용해물을 1.5 ml 원심분리기 튜브 내에 두고, 탁상형 원심분리기를 사용하여 15분 동안 4 ℃ 및 10,000 내지 15,000 xg에서 원심분리하였다. 튜브를 원심분리기로부터 꺼내어, 즉시 빙상에 두었다. 200 ㎕ 피펫 팁을 이용하여 상등액을 조심스럽게 수거하고, 몇몇 튜브로부터의 상등액을 취합하고, 빙상에 두었다. 이 상등액은 "유사분열 세포질" 또는 "MS15" 추출물이었다. 염색질 덩어리를 생산하기 위해 일상 또는 미세방법을 이용할 것인가에 따라 이 세포 추출물을 1 튜브 당 50 ㎕ 또는 10 ㎕ 부피의 추출물로 빙상의 튜브에 분취할 수 있다. 추출물을 액체 질소 상에서 즉시 순간-동결시키고, 사용할 때까지 -80 ℃에 저장하였다. 별법으로는, 세포 추출물을 빙상의 초원심분리기 튜브에 둔다 (예컨대, SW55 Ti 로터용; 베크만 (Beckman)). 필요에 따라, 튜브 상부를 미네랄 오일로 덮는다. 추출물을 3시간 동안 4 ℃ 및 200,000 xg에서 원심분리하여 MS15 추출물에 함유된 막 소포를 침강시켰다. 원심분리가 끝나면, 오일을 제거하였다. 상등액을 조심스럽게 수거하고, 필요에 따라 취합하고, 빙상의 1.5 ml 냉각 튜브 내에 두었다. 이 상등액을 "MS200" 또는 "유사분열 세포질" 추출물로서 칭한다. MS15 추출물에 대해 기재한 바와 같이 추출물을 분취하고, 동결시켰다.
필요에 따라, 추출물을 추가의 핵 인자로 풍부화시킬 수 있다. 예를 들면, 리프로그래밍 추출물이 유도된 세포 유형의 세포, 또는 임의의 다른 세포 유형의 세포로부터 핵을 정제하고, 상기 기재한 바와 같이 초음파분해로 용해시킬 수 있다. 교반하에 0.15-800 mM 농도의 NaCl 또는 KCl을 함유한 핵 완충액에서 10-60분 인큐베이션하여 핵 인자를 추출하였다. 용해물을 원심분리하여 추출이 불가능한 성분을 침강시켰다. 추출된 대상 인자를 함유한 상등액을 투석하여 NaCl 또는 KCl을 제거하였다. 투석된 핵 추출물을 분취하고, 동결 저장하였다. 이 핵 추출물을 리프로그래밍을 위해 핵을 첨가하기 전에 다양한 농도로 상기 기재한 전 세포 추출물에 첨가하였다.
또한, 유사분열 추출물을 생식 세포, 예컨대 난모세포 또는 수컷 생식 세포로부터 제조할 수도 있다. 예를 들면, 이 단계에서 자연적으로 정체된 세포 분열 중기 II 난모세포를 난모세포 추출물의 생산에 대해 상기 기재한 바와 같이 수확하고, 세척하고, 용해시켰다. 수컷 생식 세포 추출물을 제조하기 위해, 도살장에서 얻은 고환으로부터 기관을 잘게 다지고, 수크로스 또는 퍼콜 구배 상에서 수확한 세포를 차등 원심분리하여 생식 세포를 단리한다. 생식 세포를 체세포 (레이디그 (Leydig) 및 세르톨리 (Sertoli))로부터 분리하고, 현탁액으로 세척하고, PBS에 침강시켰다. 이어서, 세포를 상기 기재한 바와 같이 빙냉 세포 용해 완충액에서 1회 세척하고, 초음파분해로 용해시켰다. 용해물을 15분 동안 4 ℃ 및 15,000 xg에서 원심분리하여 투명하게 하고, 상등액 (즉, 생식 세포 추출물)을 분취하고, 액체 질소에서 순간-동결시켰다.
세포 추출물에 대한 대안으로, 하나 이상의 자연적 발생 또는 재조합 인자 (예컨대, 핵산 또는 단백질, 예컨대 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성자, 리프레서, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 사이토카인, 또는 다른 호르몬)를 용액, 예컨대 완충액에 첨가함으로써 리프로그래밍 배지를 형성시킬 수도 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 인자는 난모세포 또는 줄기 세포에 특이적이다.
응축된 염색질 덩어리의 형성
MS15 또는 MS200 추출물 또는 유사분열 배지의 분취물을 빙상에서 해동시켰다. ATP-생산 시스템 (0.6 ㎕)을 추출물 또는 배지 20 ㎕에 첨가하고, 볼텍싱에 의해 혼합하였다. ATP-생산 시스템을 제조하기 위해, 동일 비율의 100 mM ATP 원액, 1 M 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나제 원액 (100 x) 2.5 mg/ml (H 2 O에서 제조함)를 혼합하고, 사용할 때까지 빙상에 저장하였다. ATP 생산 시스템을 추출물에 첨가한 후에, 최종 농도는 ATP 1 mM, 크레아틴 포스페이트 10 mM, 및 크레아틴 키나제 25 ㎍/ml이었다.
핵 현탁액을 추출물 또는 배지 10 ㎕ 당 핵 1 ㎕의 농도로 추출물 또는 배지에 첨가하고, 피펫팅으로 잘 혼합하고, 30, 33, 35, 37 또는 39 ℃의 수조에서 인큐베이션하였다. 혼합물을 함유한 튜브를 일정한 간격으로 완만하게 가볍게 쳐서 튜브 바닥에 염색체가 응집되는 것을 막았다. 핵막 붕괴 및 염색체 응축을 일정한 간격으로, 예컨대 매 15분 마다 현미경으로 모니터링하였다. 핵막이 붕괴되고 염색체가 응축을 시작할 때, 추출물 또는 배지로부터의 염색질 덩어리의 회수 절차를 시작하였다.
별법으로는, 단리된 핵을 핵 매트릭스 단백질 NuMA에 대한 항체와 함께 예비-로딩한 후에 상기 절차를 수행함으로써 응축되지 않거나 또는 단지 부분적으로 응축된 염색질 덩어리를 형성시킬 수 있다 [Steen et al., J. Cell Biol. 149, 531-536, 2000]. 이 절차는 공여자 핵을 둘러싸는 핵 막의 용해에 의해 염색질로부터 핵 성분을 제거할 수 있지만, 응축 단계는 항-NuMA 항체의 첨가에 의해 저해된다. 염색체 응축을 방지하면, 염색체가 유사분열 추출물 중에서 인큐베이션되는 동안 염색체 붕괴 또는 손실의 위험을 감소시킬 수 있다.
이 절차를 위해, 정제한 세포 핵 (1 ㎕ 당 2,000개의 핵)을 15분 동안 실온에서 리소레시틴 0.75 ㎍/ml를 함유한 핵 완충액 500 ㎕에서 투과가능화하였다. 과량의 리소레시틴을 핵 완충액 중의 3％ BSA 1 ml를 첨가하고, 5분 동안 빙상에서 인큐베이션하여 켄칭시켰다. 핵을 이어서 침강시키고, 핵 완충액에서 1회 세척하였다. 핵을 항-NuMA 항체를 함유한 핵 완충액 100 ㎕에서 1 ㎕ 당 2,000개의 핵으로 재현탁하였다 (1:40 희석; 트랜스덕션 레버러토리즈 (Transduction Laboratories)). 완만하게 교반하면서 1시간 동안 빙상에서 인큐베이션한 후에, 핵을 1 M 수크로스를 통해 20분 동안 500 xg에서 침강시켰다. 이어서, 핵을 핵 완충액에 재현탁하고, 상기 단락에 기재한 바와 같이 ATP 재생산 시스템을 함유한 유사분열 추출물 또는 배지에 첨가하였다. 임의로, 항-NuMA 항체를 추출물 또는 배지에 첨가하여 염색체 응축을 추가로 방지할 수 있다.
응축되지 않거나 또는 단지 부분적으로 응축된 염색질 덩어리는 디터전트 또는 단백질 키나제에 노출시켜 형성시킬 수도 있다. 디터전트를 사용하여 핵 중의 염색체에 결합되지 않거나 또는 느슨하게 결합된 핵 성분을 가용화시킨 결과, 핵막을 제거할 수 있다. 이 절차를 위해, 디터전트, 예컨대 0.1％ 내지 0.5％ 트리톤 X-100 또는 NP-40을 보충한 핵 완충액에 정제된 세포 핵 (1 ㎕ 당 2,000-10,000개의 핵)을 인큐베이션하였다. 핵막의 제거를 촉진하기 위해, 추가의 염, 예컨대 NaCl을 대략 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75 또는 1 M의 농도로 완충액에 첨가할 수 있다. 빙상에서 30-60분 동안 완만하게 진탕하면서 인큐베이션한 후에, 총 부피에 따라 10-30분 동안 1,000 xg의 스윙 아웃 로터에서 원심분리하여 핵을 침강시켰다. 펠릿화된 핵을 핵 완충액 0.5 내지 1 ml에 재현탁하고, 상기 기재한 바와 같이 침강시켰다. 이 세척 절차를 2회 반복하여 디터전트 및 여분의 염을 확실하게 제거하였다.
별법으로는, 재조합 또는 자연 발생 단백질 키나제를 단독으로 또는 조합으로 사용하여 핵막을 제거할 수 있다. 바람직하게는, 표준 방법을 이용하여 단백질 키나제를 정제하거나 또는 시판 공급원으로부터 정제된 형태를 얻는다. 이들 키나제는 핵막, 핵 매트릭스 또는 염색질의 성분을 인산화하여 핵막을 제거할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Collas and Courvalin, Trends Cell Biol. 10: 5-8, 2000] 참조). 바람직한 키나제에는 사이클린-의존 키나제 1 (CDK1), 단백질 키나제 C (PKC), 단백질 키나제 A (PKA), MAP 키나제, 칼슘/칼모듈린-의존 키나제 (CamKII), 및 CK1 카제인 키나제, 또는 CK2 카제인 키나제가 포함된다. 이 방법을 위해, 대략 20,000개의 정제된 핵을 1.5 ml 원심분리기 튜브 내에서 실온의 인산화 완충액 20 ㎕에서 인큐베이션하였다. CDK1에 바람직한 인산화 완충액 (업스테이트 바이오테크놀로지스 (Upstate Biotechnologies))은 200 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2-7.6), 10 mM MgS0 4 , 80 mM β-글리세로포스페이트, 5 mM EGTA, 100 μM ATP 및 1 mM DTT를 함유하였다. PKC의 경우, 바람직한 완충액은 200 mM NaCl, 50 mM 트리스-HCl (pH 7.2-7.6), 10 mM MgS0 4 , 100 μM CaCl 2 , 40 ㎍/ml 포스파티딜세린, 20 μM 디아실글리세롤, 100 μM ATP 및 1 mM DTT를 함유하였다. PKC 및 CDK1을 모두 동시에 사용하는 경우에, 포스파티딜세린 40 ㎍/ml 및 20 μM 디아실글리세롤을 보충한 CDK1 인산화 완충액을 사용하였다. PKA에 바람직한 인산화 완충액은 200 mM NaCl, 10 mM MgS0 4 , 10 mM 트리스, pH 7.0, 1 mM EDTA 및 100 μM ATP를 함유한다. MAP 키나제의 경우, 10 mM CaCl 2 및 1 mM DTT를 보충한 PKA 인산화 완충액을 사용할 수 있다. CamKII의 경우, 1 mM DTT를 보충한 PKA 완충액 또는 업스테이트 바이오테크놀로지로부터의 Cam 키나제 분석 키트 [Venema et al. J. Biol. Chem 272:28187-90, 1997]를 사용하였다.
단백질 키나제를 최종량 25-100 ng으로 첨가함으로써 인산화 반응을 개시시켰다. 반응물을 실온에서 1시간 이하 동안 인큐베이션하였다. 핵막 붕괴를 현미경으로 상기 인큐베이션 동안, 예컨대 15분 간격으로 모니터링할 수 있다. 핵막 붕괴 후에, 디터전트 용액의 제거에 대해 상기 기재한 바와 같이 핵을 3회 세척하였다.
염색질 덩어리의 회수
응축되거나, 부분적으로 응축되거나, 또는 응축되지 않은 염색질 덩어리를 함유하는 추출물 또는 용액을 핵 완충액으로 제조한 동일 부피의 1 M 수크로스 용액 하에 두었다. 염색질 덩어리를 샘플 부피에 따라 10-30분 동안 4 ℃ 및 1,000 xg의 스윙 아웃 로터에서 원심분리하여 침강시켰다. 상등액을 제거하고, 펠릿화된 염색질 덩어리를 핵 완충액 또는 지질융합 완충액 (대략 pH 7.0 또는 pH 7.5의 20 mM HEPES, 또는 대략 pH 6.2의 20 mM MES 중의 150 mM NaCl, 10 μM 아프로티닌, 10 μM 류펩틴, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 대두 트립신 저해제 및 100 μM PMSF) 0.1-1.0 ml에서 피펫팅하여 조심스럽게 재현탁하고, 1,000 xg에서 10-30분 동안 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 펠릿화된 염색질 덩어리를 핵 완충액 또는 지질융합 완충액에서 재현탁하고, 사용할 때까지 빙상에 저장하였다. 각각의 염색질 덩어리를 미세조작 접시 중의 오일 하의 20 ㎕ 액적의 HEPES-완충 배지로 옮겼다. 하기 기재하는 바와 같이 하나의 염색질 덩어리를 각각의 핵제거된 난모세포 내로 삽입하였다.
염색질 덩어리의 제조를 위한 미세 방법
상기 기재한 바와 같이 ATP 생산 시스템, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액을 함유한 10-20 ㎕ 액적의 MS15 또는 MS200 추출물 또는 유사분열 배지를 페트리 접시에 두었다. 배양 배지 중의 단리된 G 1 단계 세포 이중체 또는 G 0 단계 세포 50 ㎕ 액적, 세포 용해를 촉진시키는데 사용되는 0.1 ％ 트리톤 X-100 또는 NP-40을 함유한 HEPES- 또는 중탄산염-완충 배지 50 ㎕ 분리 "용해" 액적 및 난모세포 주입 배지 50 ㎕ 액적을 이어서 첨가하였다. 각각의 이들 액적들을 CO 2 평형화된 미네랄 오일로 덮었다. 또한, 50 ㎕ "세척 액적"의 배양 배지를 용해된 세포 또는 핵의 세척에 사용하기 위한 페트리 접시에 첨가하였다.
미세 피펫을 사용하여 세포를 용해 액적으로 옮겼다. 완만한 반복 흡인에 의해 세포막을 피펫에서 용해시켰다. 세포를 용해할 때, 용해물을 세척 액적 내로 완만하게 제거하고, 핵을 즉시 재흡인하여 디터전트를 제거하였다. 임의로, 핵을 투과가능화하고, 유사분열 추출물 또는 배지에 첨가하기 전에 항-NuMA 항체와 인큐베이션하였다. 이어서, 핵을 MS15, MS200, 또는 배지, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액의 액적 내로 배출하였다. 핵 붕괴 및 염색체 응축을 상기 기재한 바와 같이 모니터링하였다. 핵막이 붕괴되었고, 유사분열 추출물을 항-NuMA 항체 없이 사용하는 경우에 염색체가 응축을 시작하고, 단일 무손상 염색질 덩어리를 미세 피펫으로 단리하고, 하기 기재하는 바와 같이 핵제거된 수용자 난모세포로 전달하였다.
난모세포의 핵제거
바람직하게는, 수용자 난모세포는 세포 분열 중기 II 단계 난모세포이다. 이 단계에서, 난모세포를 활성화시키거나 또는 이미 충분하게 활성화되어, 수정 정자를 처리하는 것과 같이 도입된 염색질 덩어리를 처리할 수 있다. 난모세포의 핵제거를 위해, 난모세포 중의 DNA의 일부 또는 바람직하게는 모두를 제거하거나 또는 불활성화시켰다. 수용자 난모세포에서 DNA의 이러한 붕괴 또는 제거는 난모세포의 유전 물질이 클로닝된 포유동물의 성장 및 발생에 기여하는 것을 방지한다. 난모세포의 전핵을 붕괴시키는 하나의 방법은 자외선에 노출시키는 것이다 [Gurdon, in Methods in Cell Biology, Xenopus Laevis: Practical Uses in cell and Molecular Biology, Kay and Peng, eds., Academic Press, California, volume 36: pages 299-309, 1991]. 별법으로는, 난모세포 전핵을 임의의 표준 기술 (예를 들면, 문헌 [McGrath and Solter, Science 220:1300-1319, 1983] 참조)로 수술적으로 제거할 수 있다. 하나의 가능한 방법으로는, 바늘을 난모세포 내에 두고, 핵을 바늘의 내부 공간 내로 흡인한다. 바늘을 이어서 원형질막의 파열 없이 난모세포로부터 제거할 수 있다 (미국 특허 제4,994,384호 및 동 제5,057,420호).
난모세포에 염색질 덩어리를 삽입하기 위한 지질융합
염색질을 하기 기재하는 바와 같이 지질융합에 의해 또는 표준 미세주입 또는 전기융합 기술 (예를 들면, 미국 특허 제4,994,384호 및 동 제5,945,577호 참조)에 의해 수용자 난모세포 내로 도입시킬 수 있다. 하기 지질융합 방법은 염색체를 다른 수용자 세포 내로 삽입하는 다른 용도에도 사용할 수 있다.
염색질 덩어리를 유사분열 추출물, 디터전트 및(또는) 염 용액, 또는 단백질 키나제 용액으로부터 원심분리에 의해 단리하고, 이어서 상기 기재한 바와 같이 지질융합 완충액으로 세척하였다. 사용할 때까지 염색질 덩어리를 빙냉 지질융합 완충액에 저장할 수 있다. 별법으로는, 염색질 덩어리를 분취하고, 액체 질소 또는 메탄올-드라이 아이스 욕조에서 동결시키고, -80 ℃에서 동결 저장하였다. 하나 이상의 융합발생제를 지질융합 완충액과 대략 5:1 내지 1:10 범위 중 각각의 비율로 혼합하여 지질융합 용액을 제조하였다. 융합발생제는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 친지질성 화합물 예컨대, 리포펙틴 (Lipofectin (등록상표)), 리포펙타민 (등록상표), DOTAP (등록상표) {N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트; C 43 H 83 NO 8 S}, DOSPA (등록상표) {2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트} 및 DOPE (등록상표) (디올레오일 포스파티딜에탄올아민)으로 이루어져 있지만 이에 제한되지는 않는다.
다른 바람직한 지질에는 천연 및 1가 또는 다가 양이온성 지질, 예컨대 4급 암모늄기를 함유하는 것이 포함된다. 추가의 바람직한 지질은 예컨대 콜레스테롤 중의 히드록실기와 지질 중의 기와의 반응으로부터 형성된 콜레스테롤 잔기를 가진다. 또 다른 바람직한 지질은 바람직하게는 탄소 원자수가 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 또는 20 내지 30인 포화 또는 불포화된 지방산을 가진다. 이들 지질은 표준 화학 합성 기술을 이용하여 합성하거나, 자연 발생 공급원으로부터 얻거나, 또는 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 구입할 수 있다 [Summers et al., Biophys J. 71(6): 3199-206, 1996; Nabekura et al., Pharm Res. 13(7): 1069-72, 1996; Walter et al., Biophys J. 66:366-376, 1994; Yang et al., Biosci Rep. 13(3): 143-157, 1993; Walter and Siegel, Biochemistry. 6: 32(13): 3271-3281, 1993]. 다른 바람직한 융합발생 화합물은 성게 알 또는 임의의 다른 공급원으로부터의 인지질, 예컨대 막 소포 분획물이다 [Collas and Poccia, J. of Cell Science 109, 1275: 1283, 1996]. 바람직하게는, 막 소포 분획과 염색체와의 접촉이 무손상 막에 의해 캡슐화된 염색체를 형성하지 않는다.
예를 들면, 양이온성 지질, 예컨대 DOTAP (등록상표)는 지질융합 완충액 중에 대략 0.1 내지 30 ㎍/ml의 농도로 사용될 수 있다. 별법으로는, 양이온성 지질과 천연 지질의 혼합물로 이루어진 리포좀 제제, 예컨대 DOPE (등록상표)가 사용될 수 있다.
새로 제조되거나 또는 동결 및 해동된 염색질 덩어리를 지질융합 용액과 혼합하여 염색질 덩어리를 화합물로 코팅하였다. 20-30 ℃의 온도에서 대략 10-30분 동안 인큐베이션하였다. 지질융합 용액 중의 염색질 덩어리를 함유한 미세액적을 CO 2 평형화된 미네랄 오일 하에 두었다. 핵제거된 수용자 난모세포를 함유한 액적을 또한 제조하였다. 지질융합제로 코팅된 염색질 덩어리를 미세 피펫 내로 들어내고, 난모세포 세포질과 투명대 사이의 난황주위 공간 내에 삽입하였다. 염색질 덩어리를 난모세포 막 옆에 두어 난모세포와 확실하게 접촉하게 하였다. 염색질 덩어리-난모세포 복합체를 20-30 ℃의 온도에서 유지하고, 융합을 현미경 하에 모니터링하였다. 일단 융합이 일어나면, 재구성된 난모세포를 하기 기재하는 바와 같이 활성화시켰다.
재구성된 난모세포의 활성화, 배양 및 이식
극체 압출 및 염색체 손실을 방지하기 위해, 난모세포를 사이토칼라신 B의 존재하에 활성화시키거나, 또는 사이토칼라신 B를 활성화 직후에 첨가할 수 있다 [Wakayama et al., PNAS 96: 14984-14989, 1999; Wakayama et al, Nature Genetics 24: 108-109, 2000]. 전기적 또는 비-전기적 수단을 재구성된 난모세포의 활성화를 위해 사용할 수 있다. 세포 활성화를 위한 전기적 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들면, 미국 특허 제4,994,384호 및 동 제5,057,420호 참조). 세포 활성화를 위한 비-전기적 수단에는 세포 분열의 가능성을 증가시키는, 당업계에 공지된 임의의 방법이 포함될 수 있다. 난모세포 활성화를 위한 비-전기적 수단의 예에는 에탄올; 이노시톨 트리스포스페이트; Ca ++ 이오노포어 및 단백질 키나제 저해제; 단백질 합성 저해제; 포르볼 에스테르; 타프시가르긴(thapsigargin), 또는 정자의 임의의 성분의 존재하에 난모세포를 인큐베이션하는 것이 포함된다. 활성화를 위한 다른 비-전기적 방법에는 난모세포에 냉각 충격 또는 기계적 스트레스를 주는 것이 포함된다. 별법으로는, 핵 전달 1 내지 3시간 후에, Sr 2+ 를 함유한 배지에서 대략 6시간 동안 난모세포를 인큐베이션하여 난모세포 및 사이토칼라신 B를 활성화시켜 세포질분열 및 극체 압출을 방지한다 [Wakayama et al., PNAS 96: 14984-14989, 1999; Wakayama et al., Nature Genetics 24: 108-109, 2000]. 클로닝된 포유동물의 유형에 따라 바람직한 활성화 기간은 다를 수 있다. 예를 들면, 가축, 예컨대 소에서, 난모세포 활성화 기간은 일반적으로 약 16-52시간, 바람직하게는 약 28-42시간의 범위이다.
활성화 후에, 난모세포를 적절한 시간 동안 배양 배지에 두어 생성된 배아가 발생하게 하였다. 2-세포 단계 또는 이후의 단계에서, 배아를 일정 기간 발생시키기 위해 양육 수용자 암컷 내로 전달하였다. 소과 동물 종의 경우, 배아를 모계 숙주로 전달하기 전에 전형적으로 포배 단계로 배양하였다 (예컨대, 대략 6-8 일 동안). 다른 클로닝된 동물의 경우, 시험관내 배양에 대한 적절한 기간은 당업자에게 공지되어 있거나 또는 일상 실험에 의해 결정할 수 있다.
포유동물 자궁 내로 배아를 착상시키는 방법은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 배아의 발생 단계는 숙주 포유동물의 발정 주기와 관련이 있다. 일단 배아를 포유동물의 자궁 내에 두면, 배아는 일정 기간 발생할 수 있다. 별법으로는, 배아를 선택된 시간까지 자궁 내에서 발생하도록 하고, 이어서 표준 수술 방법을 이용하여 배아 (또는 태아)를 적출하여 그의 건강 및 생존능을 측정한다. 하나의 종으로부터의 배아를 또 다른 종으로부터의 동물의 자궁 환경 내에 둘 수 있다. 예를 들면, 소과 동물 배아를 양의 난관에서 발생시킬 수 있다 [Stice and Keefer, Biology of Reproduction 48: 715-719, 1993]. 배아와 자궁 간의 임의의 교차-종 관계를 본 발명의 방법에 이용할 수 있다.
핵과 난모세포 또는 다른 수용체 세포와의 지질융합
상기 기재한 바와 같이 대략 5:1 내지 1:10 범위 중 각각의 비율로 하나 이상의 융합발생제를 지질융합 완충액과 혼합함으로써 지질융합 용액을 제조하였다. 상기 기재한 바와 같이 새로 제조하거나 또는 동결 및 해동한 핵을 지질융합 용액과 혼합하여 핵을 화합물로 코팅하였다. 20-30 ℃의 온도에서 대략 10-30 분의 기간 동안 인큐베이션하였다. 지질융합 용액 중의 핵을 함유한 미세액적을 CO 2 평형화된 광유 하에 두었다. 수용체 세포를 함유한 액적, 바람직하게는 핵제거된 세포를 함유한 액적을 또한 제조한다. 상기 기재한 바와 같이, 미세조작에 의해 염색체 또는 핵을 물리적으로 제거하거나 또는 UV 광에 노출시켜 유전 물질을 손상시킴으로써 핵제거된 수용체 세포를 제조한다. 난모세포 내에 삽입시키기 위해, 지질융합제로 코팅한 핵을 미세 피펫 내로 들어내고, 난모세포 세포질과 투명대 사이의 난황주위 공간 내에 삽입하였다. 다른 수용체 세포 내에 삽입시키기 위해, 바람직하게는 코팅된 핵을 세포 막 옆에 두어 세포와 확실하게 접촉하게 하였다. 핵-세포 복합체를 20-30 ℃의 온도에서 유지하고, 융합을 현미경 하에 모니터링하였다. 일단 융합이 일어나면 재구성된 난모세포를 상기 기재한 바와 같이 활성화시켰다.
실시예 12: 포유동물을 클로닝하기 위한 리프로그래밍된 투과가능해진 세포의 사용
세포로부터의 핵 또는 염색질 덩어리의 단리를 요구하지 않은 채 세포를 또한 리프로그래밍할 수 있다. 이 방법에서, 세포를 투과가능하게 하고, 이어서 배지 (예컨대, 세포 추출물)와 세포 간의 인자의 교환을 가능하게 하는 조건하에 간기 또는 유사분열 리프로그래밍 배지에서 인큐베이션하였다. 간기 배지를 사용하는 경우에, 세포 중의 핵은 여전히 막 결합되어 있고; 유사분열 배지를 사용하는 경우에, 핵 외피 파괴 및 염색질 응축이 발생할 수 있다. 핵을 이 배지 중에서 인큐베이션하여 리프로그래밍한 후에, 원형질막이 바람직하게는 재밀봉되어, 배지로부터의 바람직한 인자를 함유한 무손상 리프로그래밍된 세포를 형성시켰다. 필요에 따라, 배지를 실시예 11에 기재한 바와 같이 추가의 핵 인자로 풍부화할 수 있다. 리프로그래밍된 세포를 이어서 수용체 난모세포와 융합시키고, 재구성된 난모세포로부터 형성된 배아를 클로닝된 포유동물을 생산하기 위한 모계 수용체 포유동물 내로 삽입하였다.
프리온 유전자에 돌연변이를 갖고 임의로 이종 Ig 유전자를 갖는 유제동물을 생산하기 위해, 상기 프리온 유전자의 대립 유전자 중 하나 이상을 돌연변이시키고, 임의로 이종 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산을 삽입시킴으로써, 리프로그래밍 이전, 그 동안 또는 그 후에 공여자 세포를 변형시켰다. 필요에 따라, 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포를 제2 핵 전달 라운드에 사용하여 추가의 클로닝된 자손을 생산할 수 있다. 초기 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포를 또한 동결시켜 추가의 클로닝된 유제동물을 생산하기 위한 공여자 세포의 공급원으로서 사용하기 위한 세포주를 형성시킬 수 있다.
세포의 투과가능화
이 절차를 이용하여 리프로그래밍할 수 있는 세포에는 동기화되지 않은 세포, 및 G 0 , G 1 , S, G 2 , 또는 M 기 또는 이들 기의 조합에서 동기화된 세포가 포함된다. 임의의 표준 방법, 예컨대 디지토닌 또는 스트렙토리신 O를 사용하는 투과가능화를 이용하여 세포를 투과가능화하였다. 간략히, 세포를 표준 방법을 이용하여 수확하고, PBS로 세척하였다. 디지토닌 투과가능화를 위해, 세포를 대략 0.001-0.1％의 농도로 디지토닌을 함유한 배양 배지에서 재현탁하고, 얼음 상에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 스트렙토리신 O를 사용하는 투과가능화의 경우, 세포를 약 15, 30 또는 60 분 동안 실온에서 스트렙토리신 O 용액에서 인큐베이션하였다 (예를 들면, 문헌 [Maghazachi et al., FASEB J. 11: 765-74, 1997] 및 본원의 참조문헌 참조). 인큐베이션 후에, 세포를 400 xg에서 10 분 동안 원심분리하여 세척하였다. 이 세척 단계를 PBS 중의 재현탁액 및 침강에 의해 2 회 반복하였다. 사용할 때까지 세포를 PBS에서 실온하에 유지하였다. 바람직하게는, 하기 기재하는 바와 같이 투과가능해진 세포를 리프로그래밍용 간기 또는 유사분열 배지에 즉시 첨가하였다.
리프로그래밍 배지의 제조
간기 리프로그래밍 추출물을 제조하기 위해, 간기 배양된 세포를 표준 방법을 이용하여 수확하고, 10 분 동안 10 ml 원뿔 튜브 내에서 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리함으로써 세척하였다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 총 부피 50 ml의 저온 PBS에 재현탁하였다. 세포를 10 분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하였다. 이 세척 단계를 반복하고, 세포 펠릿을 대략 20 부피의 빙냉 간기 세포 용해 완충액 (20 mM HEPES, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 1 mM DTT, 10 μM 아프로티닌, 10 μM 류펩틴, 10 μM 펩스타틴 A, 10 μM 대두 트립신 억제제, 100 μM PMSF 및 임의로 사이토칼라신 B 20 ㎍/ml)에 재현탁하였다. 세포를 10 분 동안 4 ℃ 및 800 xg에서 원심분리하여 침강시켰다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 단지 1 부피의 간기 세포 용해 완충액에서 조심스럽게 재현탁하였다. 세포를 얼음 상에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 팽윤시켰다. 팁 초음파분해기를 이용하는 초음파분해 또는 유리 막자사발 및 막자를 이용하는 다운스 균질화로 세포를 용해시켰다. 90％ 이상의 세포 및 핵이 용해될 때까지 세포 용해를 수행하여, 결과를 위상차 현미경을 이용하여 평가할 수 있다. 90％ 이상의 세포 및 핵을 용해시키는 데 요구되는 초음파분해 시간은 추출물의 제조에 사용되는 세포 유형에 따라 달라질 수 있다.
세포 용해물을 1.5 ml 원심분리기 튜브 내에 두고, 테이블 탑 원심분리기를 이용하여 15 분 동안 4 ℃ 및 10,000 내지 15, 000 xg에서 원심분리하였다. 원심분리기로부터 튜브를 들어내고, 즉시 얼음 상에 두었다. 200 ㎕ 피펫 팁을 이용하여 상등액을 조심스럽게 수거하고, 수개의 튜브로부터의 상등액을 취합하고, 얼음 상에 두었다. 이 상등액은 "간기 세포질" 또는 "IS15" 추출물이었다. 이 세포 추출물을 튜브 당 20 ㎕ 부피의 추출물로 얼음 상의 튜브 내로 분취하고, 액체 질소 상에서 즉시 순간-동결시키고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하였다. 별법으로는, 세포 추출물을 얼음 상의 초원심분리기 튜브 (예컨대, SW55 Ti 로터용; 베크만) 내에 둔다. 필요에 따라, 튜브 상부를 광유로 오버레이한다. 추출물을 3 시간 동안 4 ℃ 및 200,000 xg에서 원심분리하여 IS15 추출물에 함유된 막 소포를 침강시켰다. 원심분리 말기에, 오일을 제거하였다. 상등액을 조심스럽게 수거하고, 필요에 따라 취합하고, 얼음 상의 1.5 ml 저온 튜브 내에 두었다. 이 상등액을 "IS200" 또는 "간기 세포질" 추출물로서 칭하였다. IS15 추출물에 대해 기재한 바와 같이 추출물을 분취하고, 동결시켰다.
필요에 따라, 추출물을 추가의 핵 인자로 풍부화할 수 있다. 예를 들면, 리프로그래밍 추출물이 유도된 세포 유형의 세포 또는 임의의 다른 세포 유형의 세포로부터 핵을 정제하고, 상기 기재한 바와 같이 초음파분해로 용해할 수 있다. 교반하에 0.15-800 mM 농도의 NaCl 또는 KCl을 함유한 핵 완충액에서 10-60 분 인큐베이션하여 핵 인자를 추출하였다. 용해물을 원심분리하여 추출이 불가능한 성분을 침강시켰다. 추출된 대상 인자를 함유한 상등액을 투석하여 NaCl 또는 KCl을 제거하였다. 투석된 핵 추출물을 분취하고, 동결 저장하였다. 리프로그래밍을 위해 이 핵 추출물을 세포를 첨가하기 전에 다양한 농도로 상기 기재한 전 세포 추출물에 첨가하였다.
또한, 간기 추출물을 생식 세포, 예컨대 난모세포 또는 수컷 생식 세포로부터 제조할 수도 있다. 예를 들면, 상기 기재한 바와 같이 난모세포를 활성화하고, 5 시간 동안 배양하여 간기로 진입하게 하였다. 이어서, EDTA를 용해 완충액에서 생략하는 것을 제외하고는 세포 분열 중기 II 난모세포 추출물에 대해 실시예 11에 기재한 바와 같이 난모세포를 처리하였다. 수컷 생식 세포 추출물을 실시예 11에 기재한 바와 같이 제조할 수 있다.
세포 추출물에 대한 대안으로, 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합 인자 (예컨대, 핵산 또는 단백질, 예컨대 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성자, 리프레서, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 사이토카인 또는 다른 호르몬)를 용액, 예컨대 완충액에 첨가함으로써 리프로그래밍 배지를 형성할 수도 있다. 바람직하게는, 하나 이상의 인자는 난모세포 또는 줄기 세포에 특이적이다.
배지 중의 세포의 리프로그래밍
투과가능해진 세포를 대략 100-1,000 세포/㎕의 농도로 상기 기재한 간기 리프로그래밍 배지 또는 실시예 11에 기재한 하나의 유사분열 리프로그래밍 배지에서 현탁하였다. ATP 생산 시스템 및 GTP를 상기 기재한 바와 같이 추출물에 첨가하고, 반응물을 2 시간 이하 동안 30-37 ℃에서 인큐베이션하여 추출물 유래의 인자의 세포 내로의 위치이동 및 인자의 활성 핵 수용 또는 염색체-결합을 촉진시켰다. 리프로그래밍된 세포를 800 xg에서 원심분리하고, 재현탁에 의해 세척하고, PBS 중에서 400 xg에서 원심분리하였다. 필요에 따라, 20-30％ 송아지 태아 혈청 (FCS)을 함유한 배양 배지, 2 mM CaCl 2 를 함유한 RPMI1640 (H 2 O 중의 1 M 원액으로부터 첨가함), 또는 2 mM CaCl 2 를 함유한 α-MEM 배지에 세포를 재현탁하고, 1-3 시간 동안 37 ℃의 일반 세포 배양 인큐베이터 내에서 인큐베이션하여 세포막을 재밀봉하게 하였다. 세포를 이어서 일반 가온 배양 배지 (10％ FCS)에서 세척하고, 추가로 표준 배양 조건을 사용하여 배양하였다. 실시예 17에 기재된 바와 같이, 리프로그래밍된 투과가능해진 세포를 난모세포로의 유전자 전달에 세포막의 재밀봉 없이 사용할 수 있다.
투과가능해진 세포를 리프로그래밍하는 다른 방법
별법으로는, 세포를 커버슬립 상에 둔 채 투과가능하게 하여 세포의 취급을 최소화시키고, 세포의 원심분리 단계를 제거함으로써 세포의 생존능을 최대화할 수 있다. 세포 (예컨대, 섬유아세포)를 12-웰 플레이트 내에서 RPMI1640 중의 16-mm 폴리-L-리신-코팅 커버슬립 상에서 50,000-100,000 세포/커버슬립으로 성장시켰다. 50 분 동안 37 ℃ 및 일상 대기에서 Ca 2+ -무함유 행크 (Hank) 균형 염 용액 (기브코 (Gibco)-BRL) 중의 200 ng/ml 스트렙토리신 O에서 세포를 투과가능하게 하였다. 필요에 따라, 이들 조건하에 투과가능해진 세포의 비율을 요오드화프로피듐 흡수를 기준으로 측정할 수 있다. 스트렙토리신 O를 흡인하고; 커버슬립을 리프로그래밍 배지 80-100 ㎕로 오버레이하고; 세포를 30 분 내지 1 시간 동안 37 ℃ 및 CO 2 대기에서 인큐베이션하였다. 리프로그래밍 배지는 바람직하게는 ATP 생산 시스템 및 1 mM의 ATP, CTP, GTP 및 UTP 각각을 함유한다. 임의로 원형질막을 재밀봉하기 위해, 2 mM CaCl 2 를 함유한 α-MEM 배지, 20-30％ 송아지 태아 혈청을 함유한 배양 배지 또는 2 mM CaCl 2 를 함유한 RPMI1640을 웰에 첨가하고, 세포를 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 별법으로는, 원형질막을 재밀봉하지 않는다.
투과가능해진 재밀봉된 세포의 비율에 대한 스트렙토리신 0 처리 효과
투과가능해진 재밀봉된 세포의 비율을 평가하기 위해, 스트렙토리신 O 인큐베이션의 투여량 및 시간 적정을 수행하였다 (표 7). 스트렙토리신 O 처리의 말기에 DNA 염색 요오드화프로피듐 0.1 ㎍/ml를 흡수시킴으로써 세포의 투과가능화를 평가하였다. 세포의 개별 군에서 재밀봉 처리의 말기에 유사하게 재밀봉을 평가하였다.
스트렙토리신 O 처리로 투과가능해지고, 유사분열 추출물에 노출된 소과 동물 섬유아세포의 생존능 평가
TUNEL 분석을 수행하여 0 또는 500 ng/ml 스트렙토리신 O로 투과가능해진 재밀봉된 세포, 또는 스트렙토리신 O로 투과가능해지고 30 또는 60 분 동안 유사분열 추출물에 노출되고 재밀봉된 세포에서 아폽토시스를 평가하였다. TUNEL-양성 세포는 아폽토시스 (즉, 세포 사멸)가 일어나는 세포이다. 데이타는 스트렙토리신 O 자체가 아폽토시스를 유도하지 않는 것으로 나타낸다 (표 8). 유사분열 추출물에 대한 30 분이 아닌 60 분 동안 스트렙토리신 0-처리 세포의 노출은 TUNEL 분석을 기준으로 하여 아폽토시스 비율의 10％ 증가를 유도하였다 (표 8). 이들 데이타를 기준으로 하여, 추출물 중의 공여자 세포의 30-분 인큐베이션은 60 분 인큐베이션보다 더 바람직하다. 30 분 인큐베이션은 세포의 면역형광 분석에 의해 조사된 핵의 대부분에서 핵 외피 파괴를 유도하는 것으로 나타났다 (약 90％, n > 100).
또한, 염색질 전달 방법에 대해 실시예 11에 기재한 바와 같이 추출물 중에서 인큐베이션하고, 완충액 N 또는 TL-HEPES 및 수크로스에서 세척한 정제된 핵에서는 아폽토시스가 일어나지 않았다 (각각 2/34 및 3/47 TUNEL 양성).
이들 클로닝 방법에 대해 선택한 투과가능화 방법은 30 분 동안 38 ℃에서의 SLO 500 ng/ml이었다. 리프로그래밍된 세포를 둘러싸는 무손상 막을 형성하기 위해 선택된 재밀봉 방법은 2 mM CaCl 2 를 함유한 α-MEM 배지 중의 2 시간 인큐베이션이었다.
프로테아제를 사용하여 세포를 투과가능화하는 다른 방법
프로테아제를 사용하는 전형적인 세포 투과가능화 방법에서, 세포 (예컨대, 섬유아세포)를 35 mm 플레이트에서 밤새 전면생장으로 성장시켰다. 5 분 동안 일반 트립신-EDTA (0.5％-5.3 mM) 절차를 이용하여 플레이트로부터 섬유아세포를 제거하였다. 섬유아세포를 PBS에서 세척하고, 이어서 1 ml TL Hepes에서 재현탁하였다. TL Hepes 중의 3 mg/ml 프로테아제의 1 ml을 세포 현탁액 (최종 프로테아제 농도가 1.5 mg/ml임) 1 ml에 첨가하고, 실온에서 1 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 HBSS 10 ml로 세척하고, HBSS 1 ml에서 재현탁하고, 계수하였다. 최소 부피로 대략 10 5 세포를 유사분열 추출물 인큐베이션에 사용하였다. MS-15 유사분열 추출물 40 ㎕를 세포 상에 30 분 동안 37 ℃에서 두었다. 세포를 이어서 TL Hepes에서 세척하고, 본원에 기재한 하나의 핵 전달 절차에 사용하였다.
이들 세포는 유사분열 추출물 중에서 인큐베이션한 후에 70-80％의 세포가 핵 외피 파괴 및 조기 염색체 응축을 겪기 때문에 투과가능화 징후를 보이며, 이는 추출물로부터의 MPF (성숙 촉진 인자) 또는 MPF의 일부 성분이 막을 횡단하였음을 나타낸다. 이 세포 투과가능화 방법을 각종 프로테아제, 예컨대 트립신, 및 각종 생식 세포, 체세포, 배아 세포, 태아 세포, 성체 세포, 분화 세포 및 비분화 세포와 함께 사용할 수 있다.
재구성된 난모세포의 형성, 활성화, 배양 및 이식
표준 미세주입 또는 전기융합 기술 (예를 들면, 미국 특허 제4,994,384호 및 제5,945,577호 참조)을 이용하여 리프로그래밍된 세포를 수용체 난모세포 내로 삽입하거나 또는 수용체 난모세포와 융합시킨다. 예를 들면, 세포를 수크로스 (예컨대, 2.5 ％ 수크로스)의 존재 또는 부재하에 표준 세포 배지 중의 난모세포 옆에 둘 수 있고, 세포를 주입 피펫 내로 뽑아낼 수 있다. 이어서, 피펫으로 수회 흡인하여 세포를 용해시키고, 세포질 성분을 핵으로부터 제거하고, 이어서 난모세포 내로 주입한다. 표준 방법, 예컨대 클로닝된 포유동물을 생산하기 위해 실시예 11에 기재한 방법을 이용하여 재구성된 난모세포를 이어서 활성화하고, 배양하고, 모 수용체 포유동물 내로 이식한다.
실시예 13: 염색질 전달 및 스트렙토리신 0-전달을 이용하는 더 완전한 핵 리프로그래밍에 대한 증거
실시예 8 내지 10에서 설명한 바와 같이, 불완전한 핵 리모델링 및 리프로그래밍은 전통적인 핵 이식 전핵 단계 배아에서 일어난다. 이러한 발견은 전핵 핵 이식 배아의 핵 외피 중의 라민 A/C의 조립 및 과잉의 NuMA 면역형광 표지화에 의해 입증되었다. 실시예 11에 기재한 염색질 덩어리 전달 방법 및 실시예 12에 기재한 세포 투과가능화 및 리프로그래밍 방법 (SLOT로도 칭함)을 이용하여 더 완벽한 핵 리프로그래밍을 달성하였다.
특히, 본 발명의 클로닝 방법은 전통적인 클로닝 방법을 이용하여 클로닝된 배아보다 시험관내 수정된 배아를 더 밀접하게 닮은 단백질 발현 패턴을 갖는 배아를 생산하였다. 실시예 8 내지 10에 기재한 바와 같이, 염색질 전달 배아는 전통적인 핵 전달 배아보다 훨씬 적은 라민 A/C 단백질을 발현하였다. 라민 A/C는 분화된 세포에서 자연적으로 발현되지만 배아에서는 발현되지 않는 핵 라미나의 체세포-특이적 성분이다. 라민과 전사 인자, 염색질 단백질 및 DNA와의 보고된 상호작용 때문에, 전통적인 핵 전달 배아 중의 라민 A/C의 발현이 배아 발생에 바람직하지 않은 체세포에 대해 특이적인 단백질의 발현을 촉진하는 것으로 여겨진다. 따라서, 본 발명의 염색질 전달 배아는 전통적인 핵 전달 배아보다 적은 바람직하지 않은 체세포-특이적 단백질을 발현할 수 있다. 또한, 전통적인 핵 이식 배아보다 시험관내 수정된 배아를 더 밀접하게 닮은 염색질 전달 배아는 전사 조절과 관련된 핵 매트릭스의 주요 성분인 NuMA에 대한 발현 패턴을 가졌다. 이 결과는 또한 염색질 전달 배아가 전통적인 핵 이식 배아보다 더 효율적으로 리프로그래밍된다는 것을 나타낸다.
소과 동물 섬유아세포 핵의 시험관내 핵 파괴의 평가
유사분열 소과 동물 섬유아세포로부터 제조된 추출물은 약 80％의 투입 정제 섬유아세포 핵의 파손을 일치하게 지지하였다 (도 33). 세포 분열 중기 II 난모세포로부터의 추출물 (즉, 수정 전에 세포 분열 중기 II에서 자연적으로 억지된 난모세포로부터의 추출물)도 또한 성공적으로 핵 파괴 (30 분 내에 75％의 핵 파괴)를 지지하였다.
투입 간기 핵 (도 34A), MS15 유사분열 추출물에서 인큐베이션한 핵으로부터 수득한 염색질 덩어리 (도 34B) 및 난모세포 추출물에서 인큐베이션한 핵으로부터 수득한 염색질 덩어리 (도 34C)를 하기 마커의 발현에 대해 조사하였다: 내부 핵 막의 내재 단백질인 라민 B 수용체 (LBR) (막 마커); 핵 라미나의 편재하는 성분인 라민 B; 분화된 세포에만 존재하고 배아에서는 부재하는 핵 라미나의 체세포-특이적 성분인 라민 A/C; 핵 매트릭스의 주요 성분인 NuMA; 핵의 PKA-앵커링 단백질인 AKAP95; 및 DNA. 체세포 세포질 MS15 및 난모세포 MS15 추출물 둘 다 조사된 약 100％의 염색질 단위에서 라민 B, 라민 A/C, LBR 및 NuMA의 가용화를 유도하였다 (도 34B 및 34C). 추측한 바와 같이, AKAP95는 유사분열 인간 세포에서 이미 관찰한 것과 같이 염색체와 결합된 채로 있었다 (문헌 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999]). 이 결과를 또한 조기 성숙 염색질 응축 단계에서의 소과 동물 핵 이식 배아에 대해 실시예 8에 기재하였다. 유사분열 추출물 및 난모세포 추출물 둘 다 사용하는 방법, 즉 전통적인 핵 이식, 핵 주입 (NI) 또는 염색질 전달과 상관없이 핵 외피의 가용화 촉진에서 무손상 난모세포만큼 효율적인 것으로 나타났다 (도 35).
염색질 전달에 의해 생산한 전핵 배아와 핵 이식 및 핵 주입 배아로부터의 전핵의 비교
염색질 전달 배아를 생산하기 위해, 시험관내-성숙 난모세포는 성숙 약 18-20 시간 후에 핵제거하였다. 본원에 기재한 바와 같이 소과 동물 태아 세포로부터 제조한 MS15 유사분열 추출물에서 간기 소과 동물 태아 섬유아세포로부터의 핵을 인큐베이션하였다. 핵 외피가 파괴된 후 및 염색질 응축이 완료되기 전에 염색질 덩어리를 추출물로부터 단리하였다. 특히, 간기 (0％ 응축 표시됨)에서의 염색체의 응축의 수준 및 유사분열 (100％ 응축 표시됨)에서의 염색체의 응축의 최고 수준을 비교하여 염색질이 대략 50-60％ 응축되었을 때 염색질 덩어리를 단리하였다. 이 단계에서, 염색질 덩어리 중의 개별 염색체는 구별될 수 없었고, 염색질 덩어리의 가장자리는 불규칙한 모양을 가졌다. 유사분열 추출물로부터 단리한 염색질 덩어리를 핵제거된 난모세포와 함께 2.5％ 수크로스를 갖는 TL HEPES의 미세액적에 두었다. 수크로스를 완충액에 첨가하여 이후의 주입 절차로부터의 난모세포에 대한 손상을 최소화하였다. 부를리 피에조 드릴 (Burleigh Piezo Drill) (미국 뉴욕주 피셔 소재) (진폭 70 V에서 75 μ 초 동안 주파수 2 Hz)을 이용하는 경사 미세주입 피펫를 이용하여 염색질 덩어리를 난모세포 내로 주입하였다. 전형적으로 다중 펄스, 예컨대 2, 3, 4 또는 5 펄스를 수행하여 주입을 위해 바늘이 충분하게 난모세포를 관통하게 하였다. 주입 후에, 난모세포를 수크로스 중의 TL HEPES의 순차 희석으로 세척하여 삼투압 충격을 최소화하였다. 성숙 28-30 시간 (즉, 난소로부터 수거한 후에 난모세포를 성숙 배지에 둔 후 28-30 시간이며, 또한 염색질 덩어리 주입 후 2 시간 이상임) 후에, 재구성된 난모세포 및 단성생식 발생에 대한 대조군을 이전에 기재한 바와 같이 (문헌 [Liu et al., Mol. Reprod. Dev. 49: 298-307, 1998]) 4 분 동안 칼슘 이오노포어 (5 μM) (캘리포니아주 샌디에이고 소재의 칼 바이오켐 (Cal Biochem))로 활성화하고, 5 시간 동안 ACM 배양 배지 [100 mM NaCl, 3 mM KCl, 0.27 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM 소듐 락테이트, 0.4 mM 피루베이트, 1 mM L-글루타민, 3 mg/ml BSA (지방산 무함유), 1％ BME 아미노산 및 1％ MEM 비필수 아미노산 (시그마)] 중의 시클로헥시미드 10 ㎍/ml 및 사이토칼라신 D (시그마 (Sigma)) 2.5 ㎍/ml로 활성화시켰다. 활성화 후에, 난을 5 회 세척하고, 마우스 태아 섬유아세포를 함유한 배양 4-웰 조직 배양 플레이트 내의 배양액에 두고, 배아 배양 배지 0.5 ml를 배아 시험 광유 (시그마) 0.3 ml로 덮었다. 25 내지 50 배아를 각각의 웰에 두고, 38.5 ℃에서 5％ CO 2 대기 중에 인큐베이션하였다. 필요에 따라, 칼슘 (예컨대, 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 3.5, 5 mM 또는 그 이상 CaCl 2 )을 첨가하여 배양 배지에서 약 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 시간 또는 그 이상 동안 배양함으로써 주입 후에 난모세포의 재밀봉을 촉진할 수 있다. 재밀봉된 난모세포는 본원에 기재한 표준 방법을 이용하여 수용체 포유동물 내로 이식하는 경우에 난모세포를 둘러싸는 무손상 층 때문에 생존율을 증가시키는 것으로 여겨진다.
추출물에서 인큐베이션하지 않은 간기 소과 동물 태아 섬유아세포 핵을 염색질 덩어리 대신에 난모세포 내로 주입하는 것을 제외하고는 핵 주입 배아를 염색질 전달 배아에 대해 상기 기재한 바와 같이 형성시켰다. 핵 이식 배아를 실시예 8에 기재한 통상의 방법을 이용하여 생산하였다.
핵 이식, 핵 주입 및 염색질 전달 전핵은 예상한 바와 같이 라민 B (도 36A, 적색 표지) 및 AKAP95 (도 36B, 적색 표지)를 재조립하였다. 핵 이식 및 핵 주입 전핵은 또한 체세포-특이적 성분이고 핵 이식 배아에 대해 상기 보고한 결과와 일치하는 라민 A/C를 재조립하였다 (도 36A, 녹색 표지). 그러나, 염색질 전달 전핵 및 대조군 파르테노트 전핵은 라민 A/C를 재조립하지 않았다 (도 36A). 대부분의 염색질 전달 또는 파르테노트 전핵 (도 36B, 녹색 표지)과는 다르게 핵 이식 전핵은 또한 NuMA (녹색 표지)를 함유하였다. 소정 비율의 파르테노트 핵 및 염색질 전달 핵은 상기 보고한 바와 같이 낮은 수준의 NuMA를 조립하였다.
핵의 시험관내 해체에 이어 염색질 전달은 대조군 파르테노트 전핵과 형태학적으로 유사한 전핵을 발생시킨다. 대조적으로는, 핵 이식 및 핵 주입 전핵은 체세포-특이적 성분 (라민 A/C 및 광범위 NuMA 표지화)을 숨긴다. 이 결과는 전통적인 핵 이식 또는 핵 주입 절차 후의 불완전한 핵 리모델링을 나타내는 것이다. 상기 기재한 바와 같이, 핵 이식 및 핵 주입 전핵에서 검출된 라민 A/C는 전핵 단계에서 새로이 전사된 라민으로부터 유래된다. 핵 라민 및 혹은 NuMA가 인간의 전사 조절 및 질환에 관련되기 때문에 통상의 핵 이식 전핵 중의 라민 A/C의 지속성은 부적절한 기능적 리프로그래밍을 나타내는 것일 수 있다. 본 발명자들은 시험관내 핵 해체 및 염색질 전달이 전통적인 핵 이식 또는 핵 주입보다 더 정상적인 전핵을 생산하는 것으로 결론지었다.
공여자 공급원으로서 리프로그래밍된 염색질 덩어리 또는 투과가능해진 세포를 사용하는 클로닝 효율
실시예 12에 기재한 바와 같이, 1차 태아 소과 동물 섬유아세포의 스트렙토리신 0 (SLO)-유도 투과가능화, 30 분 동안의 리프로그래밍 배지 (예컨대, 유사분열 추출물)에 대한 투과가능해진 세포의 노출, 임의로 배양물 중에 2 mM 칼슘을 사용하는 섬유아세포의 재밀봉, 및 표준 세포 융합 방법을 이용하는 난모세포 내로의 염색질의 전달을 포함하는 "SLOT"라 칭하는 신규한 클로닝 절차를 개발하였다.
이 클로닝 방법을 위해, 스트렙토리신 O의 1 바이알 (시그마 S-5265; 4 ℃에서 저장 분말형으로 저장한 25,000 단위)을 H 2 O 400 ㎕에 용해하고, 잘 혼합하였다. 모든 함유물을 15 ml 원뿔 튜브로 옮기고, 이어서 H 2 O 3.6 ml를 첨가하고, 볼텍싱으로 혼합하였다. 분취물 10 ㎕를 -20 ℃에서 0.062 U/㎕의 원액 농도로 동결시켰다. 세포 (약 100,000개)를 실온에서 HBSS (기브코 BRL, 카탈로그 제14170-120호) 100 ㎕에 현탁하였다. 이들 세포를 전면생장시키고, 이로써 약 80 내지 85％의 세포가 G1 단계이었고, 대부분의 다른 세포는 S 단계이었다. 스트렙토리신 O 원액 (5 ㎕) (즉, 최종 농도 500 ng/ml 또는 0.3 U/㎕)을 첨가하고, 혼합물을 38 ℃에서 25 분 동안 수조 내에서 인큐베이션하였다. 튜브를 인큐베이션 동안 부드럽게 2-3 회 가볍게 쳐서 확실하게 세포가 현탁액 중에 남아 있게 하였다. 실온의 PBS (200 ㎕)를 첨가하고, 부드러운 피펫팅으로 잘 혼합하였다. 세포를 탁상형 원심분리기 내에서 5 분 동안 실온 및 5,000 rpm에서 원심분리하였다. 모든 상등액을 제거하였다. 이 단계에서 펠릿은 작고, 명확하게 눈에 보이지 않을 수 있다. ATP-생산 시스템 (40 ㎕, "MS15")을 함유한 유사분열 추출물을 첨가하고, 잘 혼합하였다. 1 바이알의 추출물 40 ㎕를 해동하고, ATP-생산 시스템 1.2 ㎕를 첨가하고, 잘 혼합하고, 실온에서 인큐베이션하여 세포의 원심분리 동안 추출물을 제조하였다. 이 유사분열 추출물은 상기 단락에서의 염색질 덩어리의 생산에 사용한 추출물과 동일하였다. 혼합물을 수조 내에서 30 분 동안 38 ℃에서 인큐베이션하고, 튜브를 때때로 부드럽게 가볍게 쳤다. 실온 재밀봉 배지 (RM, 500 ㎕) (CaCl 2 를 1 M 원액로부터 2 mM로 보충한 완전 α-MEM [바이오-휘태커 (Bio-Whittaker)] 배지)를 첨가하였다. 튜브를 개봉한 채 두고, 튜브를 가끔씩 가볍게 쳐면서 CO 2 인큐베이터 내에서 2 시간 동안 인큐베이션하여 확실하게 세포가 현탁액에 남아 있게 하였다. 세포를 테이블 탑 원심분리기 내에서 5 분 동안 실온 및 5,000 rpm에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 실온 TL HEPES (바이오-휘태커, 카탈로그 제04-616F호) 100 ㎕에서 재현탁하고, 또 다른 TL HEPES 900 ㎕를 첨가하였다. 핵 전달을 표준 방법을 이용하여 수행하였다. 난모세포를 활성화하고, 염색질 전달에 대해 상기 단락에 기재한 바와 같이 수용체 포유동물에 전달하였다.
이 SLOT 방법 및 본 발명의 염색질 전달 방법을 이용하여 형성시킨 배아의 발생을 하기 표 9에 요약하였다. 포배 단계의 발생은 통상의 핵 전달 배아에 비해 SLOT 배아의 경우 약간 더 낮았다. 포배 단계에서의 SLOT 및 핵 전달 발생 간의 차이는 SLOT에 대한 것보다 핵 전달에 대한 세포 주기의 G1 기에서 더 높은 비율의 세포를 사용한 결과 때문일 수 있다. 생존율은 염색질 전달 배아의 경우 더 낮은데, 이는 침입 과정의 경우에 예상되는 것이다.
임신 제40일에 핵 전달 및 SLOT 배아에 대한 임신율은 유사하였다 (표 9). 임신 제40일 내지 제60일의 생존율은 통상의 방법을 이용하여 생산한 핵 전달 배아보다 SLOT 배아의 경우 더 높은 경향이었다.
상기 기재한 바와 같이, 재구성된 난모세포를 수 시간 동안 칼슘 중에 인큐베이션하여 수용체 포유동물 내에 삽입하기 전에 난모세포를 재밀봉시킴으로써 염색질 전달 배아에 대한 생존율을 증가시킬 수 있다. 또한, 세포를 배양물로부터 들어내는 때와 세포를 난모세포와 융합시키는 때 사이의 시간을 감소시킴으로써 SLOT 배아에 대한 생존율을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 스트렙토리신 O 중의 인큐베이션, 리프로그래밍 배지 중의 인큐베이션 및(또는) 재밀봉 배지 중의 인큐베이션의 시간을 단축시킬 수 있다. 특히, 재밀봉 배지 중의 인큐베이션을 대략 1 시간 이하로 단축시킬 수 있다. 이렇게 단축된 재밀봉 처리는 상기 기재한 바와 같이 2 mM 칼슘 또는 더 높은 농도의 칼슘 (예컨대, 약 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0 또는 6.0 mM 칼슘)의 존재하에 수행하여 재밀봉율을 증대시킬 수 있다. 세포를 난모세포와의 융합 전에 처리하는 시간을 감소시킴으로써, 세포가 S 기 진입하여 DNA 복제를 개시하여 재구성된 난모세포의 생존율을 감소시키는 경향을 감소시킬 수 있다.
실시예 14: 염색질 전달을 사용하는 더 완전한 핵 리프로그래밍에 대한 증거
실시예 11에서 논의한 바와 같이, 공여자 핵의 리모델링을 강화하고, 체세포 유전자의 억제를 촉진하고, 수정된 접합체와 유사한 전핵 구조를 갖는 배아를 생산하는 방법을 개발하였다. 이 일반 염색질 전달 방법의 특정 예에서는, 핵 해체를 유도하는 데 요구되는 ATP-생산 시스템의 존재하에 단리된 무손상 소과 동물 섬유아세포 핵을 유사분열 소과 동물 섬유아세포의 세포질 추출물 중에 인큐베이션하였다.
공여자 핵을 염색질 덩어리로 전환시키기 위한 유사분열 리프로그래밍 추출물을 생산하기 위해 섬유아세포를 노코다졸 0.5 ㎍/ml로 약 18 시간 동안 유사분열에서 동기화하고, 유사분열물을 진탕해내어 수확하고, 빙냉 PBS로 2 회 및 빙냉 세포 용해 완충액 (20 mM Hepes, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 10 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제)으로 1 회 세척하였다 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999]. 팩킹된 세포를 1 부피의 세포 용해 완충액에 재현탁하고, 빙상에서 1 시간 동안 팽윤시키고, 모든 세포가 용해될 때까지 딱 맞는 막자를 이용하여 빙상에서 다운스-균질화시켰다. 용해물을 15 분 동안 15,000 xg 및 4 ℃에서 원심분리하고, 상등액 (유사분열 추출물)을 수거하고, 분취하고, 액체 질소에서 순간-동결시키고, -80 ℃에서 저장하였다.
공여자 염색질을 생산하기 위해, 동기화되지 않은 전면생장 섬유아세포를 수확하고, 세척하고, 약 20 부피의 빙냉 저장성 핵 단리 완충액 (10 mM Hepes, pH 7.5, 2 mm MgCl 2 , 25 mM KCl, 1 mm DTT, 및 프로테아제 억제제의 칵테일)에서 재현탁하였다 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999]. 빙상에서 1 시간 후에, 딱 맞는 막자를 이용하여 세포를 다운스-균질화시켰다. 2 M 원액으로부터 250 mM의 농도로 수크로스를 첨가하고, 핵을 10 분 동안 400 xg 및 4 ℃에서 침강시켰다. 핵을 핵 단리 완충액 (상기와 동일하지만 250 mM 수크로스를 갖는 완충액)에서 세척하고, 신선하거나 또는 핵 단리 완충액/70％ 글리세롤 중에 동결된 것을 사용하였다 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1179, 1999].
리프로그래밍을 위해, 단리된 섬유아세포 핵을 38 ℃의 H 2 O 욕조 내에서 ATP-생산 시스템 (1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 포스페이트 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)을 함유한 유사분열 추출물 40 ㎕ 중에 4,000 핵/㎕로 30 분 동안 인큐베이션하였다. 핵 외피 파괴 및 염색질 응축을 위상차 현미경으로 모니터링하였다. 인큐베이션 말기에 반응 혼합물을 2.5％ 수크로스를 함유한 TL Hepes 500 ㎕로 희석하고, 염색질을 2,000 xg에서 5 분 동안 침강시켜 회수하였다. 염색질 덩어리를 TL Hepes/수크로스에서 재현탁하고, 핵제거된 난모세포와 함께 광유 하의 TL Hepes/수크로스로 옮겼다. 부를리 피에조 드릴 (뉴욕주 피셔 소재) (2 Hz, 2 μs, 70 V)을 이용하는 경사 미세주입 피펫으로 20 hpm에서 핵제거된 시험관내-성숙 난모세포 내로 개별 염색질 덩어리를 주입하였다. 주입 후에, 난모세포를 TL Hepes 중의 수크로스의 순차 희석물에서 세척하여 삼투압 충격을 최소화하고, 배양하였다. 28 hpm에서, 다시 제조된 난모세포 및 단성생식 대조군을 NT에 대해 기재한 바와 같이 활성화하고, 배양하였다 [Kasinathan et al., Nat. Biotechnol. 19: 1176-1178, 2001 and Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001]. 핵 주입 (NI)을 위해, 정제된 섬유아세포 핵을 유사분열 추출물 대신에 세포 용해 완충액에 노출시키고, CT에서와 같이 핵제거된 난모세포 내로 주입하였다.
리프로그래밍 결과로서, 라민 A/C, 라민 B 및 NuMA는 용이하게 해체되는 반면, AKAP95는 응축된 염색체와 결합된 채 있었다 (도 42A). TUNEL 분석은 아폽토시스가 추출물에서 일어나지 않은 것으로 나타냈다. 인간 HeLa 핵 및 유사분열 추출물을 사용하는 유사한 핵 파괴의 연구는 응축된 염색질 덩어리가 간기 세포질 중의 핵 재구성 [Steen et al., J. Cell Biol. 150: 1251-1562, 2000] 및 전사를 지지할 수 있음을 나타냈다. 따라서, 시험관내 핵 해체는 기능적 핵을 재형성할 수 있는 응축된 염색질을 생산한다. 응축된 섬유아세포 염색질을 침강으로 회수하고, 개별 염색질 덩어리를 핵제거된 수용체 난모세포 내로 주입하였다. 배양물에서 회수한 후에, 난모세포를 NT 난모세포에 대해 실시예 9에 기재한 바와 같이 활성화시켰다. 핵의 취급에 의해 생산되는 인공물에 대해 대조하기 위해, 추출 완충액에만 노출된 무손상 핵을 또한 주입하였다.
CT 및 대조군 핵 주입 (NI) 결과를 도 42A 내지 42D에 나타내었다. NI는 NT 전핵과 같이 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95를 함유한 전핵을 생산하였다 (도 42B 및 42C). CT는 주입 및 활성화에 대해 생존한 배아의 80％를 초과하는데서 PN을 형성시켰다 (주입된 난모세포의 약 50％, n > 2,000). 그러나, CT 전핵은 라민 A/C가 검출 불가능하고, NT 및 NI 전핵에 비해 항-NuMA 면역표지가 3 배 감소된 것으로 나타났다 (도 42B 및 42C). 이 패턴은 단성생식 전핵의 패턴과 유사하였다. 상기 기재한 바와 같이 트리톤 X- 100/DNAse I/NaCl을 사용하는 AKAP95 및 DNA의 추출가능성은 NT 전핵에 비해 CT 전핵에서 8 배 향상되었으며, 이는 전핵 AKAP95 앵커링 및 DNAse I 접근성에 대한 CT의 유익한 영향을 반영한다 (도 42D). 염색질-결합된 AKAP95가 우선적으로 전사 억제된 (저아세틸화된) 염색질과 공동-분획화하기 때문에, 이 결과는 CT가 PN 조립시에 농염색질 (euchromatin)의 형성을 증가시킨다는 것을 제안한다.
TATA 결합 단백질인 TBP의 동태를 섬유아세포 공여자 핵 리모델링 동안 동시에 수행하는 NT 및 CT 절차에 의해 조사하였다. TBP는 실질적으로 모든 유전자에 대한 일반 전사 기구의 조립을 촉진한다 [Sharp et al., Cell 68: 819-821, 1992]. TBP는 공여자 섬유아세포 핵 중에서 AKAP95 및 DNA와 공동-위치하였다 (도 43A). TBP/AKAP95 및 TBP/DNA 형광 강도 비율로 나타낸 바와 같이, NT 후에 수득한 PCC 염색체는 유사분열 추출물 중에 응축된 염색체보다 TBP를 5 배 더 함유하였다 (도 43B). 시험관내 응축된 염색체의 TPB 표지 강도는 유사분열 섬유아세포와 닮았다. PN 단계에서, TBP는 CT 배아에서 거의 검출가능하지 않지만, NT 및 NI 배아에서 강한 면역반응성을 나타내었다 (도 43A). 전사 또는 번역의 억제는 강한 TBP 표지화를 유지하기 때문에 NT 배아에서의 전핵 TBP는 체세포 기원이었다. 마우스에서의 전핵 TBP 농도는 간기를 통한 진행 동안 증가되는 것으로 나타났다 [Worrad et al., Development 120: 2347-2357, 1994]. 그러나, 재구성된 NT와 CT 배아 간의 PCC- 또는 시험관내-응축된 염색질로부터의 PN 형성의 반응속도의 유사성은 NT 전핵에서의 증가된 TBP 농도가 더 진행된 세포 주기 단계로 인한 것이 아님을 나타냈다. 따라서, 공여자 핵의 시험관내 해체는 염색질로부터의 TBP의 분리를 촉진하여 생성된 CT 전핵이 재구성의 동일한 단계에서 NT 전핵보다 TBP를 약 10 배 덜 함유한다.
따라서, NT에 의한 불완전한 리프로그래밍의 5 개의 구조적 및 기능적 마커는 라민 A/C의 전핵 조립, 증가된 전핵 NuMA 및 TBP 농도, 및 디터전트, DNAse 및 염을 사용한 추출에 대한 AKAP95 및 DNA의 증가된 감수성을 포함한다. 대조적으로는 적절한 핵 재형성 및 세포 생존에 필수인 B 형 라민 [Steen et al., J. Cell Biol. 153: 621-626, 2001]은 NT 전핵에서 정상적으로 조립되는 것으로 나타나지만, 본 발명자들은 조립된 B 형 라민의 푸울이 체세포 기원인지 (따라서, 재표적화됨) 또는 모계 기원인지를 결정할 수 없었다. LMNA 유전자가 NT 전핵에서 활성이 남아 있어서 분화된 세포-특이적 A 형 라민을 조립한다. 염색질과 전사 기구와의 상호작용을 통해 핵 라민은 전사 조절에 참여하므로 [Cohen et al., Trends Biochem. Sci. 26: 41-47, 2001] 핵 라민의 정확한 세트(들)의 조립이 NT 배아에서 적절한 전핵 기능에 대해 가장 중요할 수 있을 것으로 제안되었다.
본 방법에서, 체세포 핵 성분은 추출물에 분산시키고, 전형적으로 난모세포 세포질과 접촉시키지 않는다. 이는 조성이 모계 라민과 다를 수 있는 발생 핵, 예컨대 B 형 라민으로의 체세포-특이적 분자의 재표적화를 방해한다 [Cohen et al., Trends Biochem. Sci. 26: 41-47, 2001]. 시험관내 염색질 응축은 또한 DNA-결합 인자, 예컨대 염색질 리모델링 효소의 유리 [Sif et al., Genes Devel. 12: 2842-2851, 1998] 및 전사 인자의 유리를 촉진하므로 잠재적인 억제성 체세포 성분의 공여자 게놈을 "스트립핑 (stripping)"할 수 있다. 특히, TBP 제거는 재구성된 CT 전핵에서 체세포-특이적 유전자를 불활성화하고, 수정 후에 수컷 전핵의 낮은 전사 활성을 두 배로 할 수 있다 [Poccia et al., Trends Biochem. Sci. 17:223-227, 1992].
공여자 핵으로부터의 인자 제거는 염색질 상으로의 모계 성분의 로딩 및 생리학상 전핵 내로의 리모델링이 촉진될 수 있다는 것을 암시한다. CT는 뉴클레아제 및 염에 대한 AKAP95 및 DNA의 감수성을 증가시킨다. DNAse I-내성 DNA는 대부분 전사를 나타내지 않으며; 따라서, NT에 의한 AKAP95 앵커의 불완전한 리모델링은 발생적으로 중요한 유전자, 예컨대 태반 발생, 임신 말기의 유지 및 클로닝된 동물의 출생후 생존과 관련된 유전자의 발현을 손상시킬 수 있다.
CT 난모세포의 하기 특성은 유사분열 추출물에서 인큐베이션한 염색질 덩어리의 핵 전달이 생성된 재구성된 난모세포의 기능적 특성을 유의하게 개선한다는 것을 나타낸다. 체세포 공여자 세포인 NuMA에 의해 고 수준으로 발현하는 핵 매트릭스 단백질은 NT 전핵보다 CT 전핵 (즉, 난모세포 내로의 염색질 덩어리의 도입 후에 형성된 전핵)에서 3 배 덜 발현되었다. 이 결과는 CT 난모세포 중의 NuMA의 수준이 NT 난모세포보다 자연 발생적인 난모세포 중의 NuMA의 수준과 더 유사하다는 것을 나타낸다. CT 전핵은 또한 NT 전핵보다 일반 전사 인자 TBP를 10배 덜 발현하였다. 유사분열 추출물에서의 인큐베이션에 의한 공여자 염색질 덩어리로부터의 TBP의 상기 제거는 생성된 CT 난모세포 중의 바람직하지 않은 체세포-특이적 유전자를 불활성화시킬 수 있다. 분화된 세포에 특이적이고, 시험관내 수정되거나 또는 단성생식적으로 활성화된 난모세포에서 검출되지 않는 핵 외피 단백질인 라민 A/C는 또한 CT 전핵에서 검출되지 않지만 NT 전핵에서 검출되었다. 핵 라민이 전사를 조절할 수 있기 때문에 CT 전핵 중의 검출가능한 라민 A/C의 결여는 NT 난모세포보다 CT 난모세포에서 전사를 더 적절하게 조절할 수 있다. 디터전트, DNase 및 염을 사용한 추출에 대해 전사 억제된 (저아세틸화된) 염색질에서 풍부한 핵 매트릭스-염색질 계면의 구조 단백질인 AKAP95 및 DNA의 감수성을 전핵에서 측정하여 DNA에 대한 AKAP95의 앵커링 및 전핵에서의 DNA 접근성을 특성화하였다. 추출능은 NT 전핵에 비해 CT 전핵에서 8 배 증대되었으며, 이는 공여자 DNA의 AKAP95 앵커링 및 형태학적 리모델링에 대한 유사분열 추출물 중의 공여자 염색질 덩어리의 인큐베이션의 유익한 효과를 반영한다. AKAP95 및 DNase I-내성 DNA가 전사적으로 억제되거나 사일런트인 DNA와 결합하기 때문에, 뉴클레아제, 염 및 디터전트에 대한 AKAP95 및 DNA의 증가된 감수성은 CT 난모세포가 발생적으로 중요한 유전자의 증가된 발현을 나타낼 수 있음을 제안한다.
프리온 유전자 중에 하나 이상의 돌연변이를 갖는 세포로부터의 공여자 핵을 사용하는 경우 유사한 결과가 예상된다.
실시예 15: 스트렙토리신 0-전달을 사용하는 더 완전한 핵 리프로그래밍에 대한 증거
SLOT를 사용하는 유사분열 추출물 중의 투과가능해진 세포의 인큐베이션 동안 염색질 덩어리의 리프로그래밍을 또한 도 45A 및 45B에 나타내었다. 이 연구에서, 체세포 공여자 세포에 의해 고 수준으로 발현되는 핵 매트릭스 단백질인 NuMA의 발현과 분화된 세포에 특이적인 핵 외피 단백질인 라민 A/C의 발현을, SLOT를 사용하여 생산한 난모세포 및 추출물 ("NT")에서 인큐베이션하지 않은 핵을 함유한 세포의 통상적인 핵 전달을 이용하여 생산한 난모세포에서 비교하였다. 활성화 14 시간 후에, SLOT 전핵 (즉, 난모세포 내로 염색질 덩어리를 함유한 공여자 세포를 도입한 후에 형성된 전핵)은 NT 전핵보다 NuMA 및 라민 A/C를 유의하게 덜 발현하였다 (3회 반복실험에서 n = 15 내지 20 배아/마커). 이들 결과는 재구성된 SLOT 난모세포가 NT 난모세포보다 더 효율적으로 리프로그래밍되고, 자연 발생 수정된 난모세포와 더 밀접하게 닮았다는 것을 나타낸다. 핵 라민이 전사를 조절할 수 있기 때문에 SLOT 전핵 중에서 유의하게 더 낮은 수준의 라민 A/C는 NT 난모세포보다 SLOT 난모세포에서 전사를 더 적절하게 조절할 수 있다.
생성된 난모세포 중의 바람직하지 않은 인자의 발현을 감소시키는 것 이외에 SLOT는 통상적인 핵 전달 방법에 비해 생성된 태아의 생존능을 증가시킨다 (표 10). 따라서, SLOT 공여자 세포의 다수의 구조적 및 기능적 차이는 실질적으로 비-인간 배아 및 비-인간 포유동물을 형성하는 재구성된 난모세포의 능력을 개선한다.
실시예 16: 스트렙토리신 0-전달 (SLOT)을 이용하는 더 완전한 핵 리프로그래밍에 대한 예시적인 증거
실시예 12 및 15에 기재한 바와 같이, 신규한 시험관내 핵 리모델링 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 공여자 세포의 투과가능화, 유사분열 세포 추출물 중의 염색질 응축의 유도 및 염색질 응축 동안 가용화된 핵 인자를 제거하기 위한 투과가능해진 세포의 세척을 수반한다. 소과 동물 염색질 이식 배아의 전핵은 체세포를 닮은, 핵 이식 배아와 반대로 정상 배아와 밀접하게 닮은 몇몇 마커의 발현 패턴을 나타낸다. 이 염색질 전달 시스템을 이용하여 건강한 송아지 8 마리를 생산하였다. 염색질 전달은 일정 기간 동안의 생존 증가, 큰 송아지의 더 낮은 발생율 및 출생 후에 유의하게 증가한 생존율의 경향을 나타낸다. 이 결과는 이식 전에 체세포 공여자 핵의 성공적인 조작을 나타낸다. 추가로 하기 기재하는 바와 같이, 유사분열 추출물 중의 체세포 핵의 해체에 이어서 응축된 염색질의 난모세포로의 전달은 핵 리모델링을 강화시키고, 클론의 개선된 발생 및 생존능의 증거를 보여준다. 이 절차는 필요에 따라 핵 리프로그래밍의 메카니즘을 추가로 특성화하기 위해 사용할 수 있다.
염색질 전달 전략
전핵 NT 배아에서 확인된 결점을 경감시키기 위해, 섬유아세포 핵을 수용체 난모세포 내로 전달하기 전에 시험관내 조작하였다. 이 SLOT 시스템을 도 48에 개설한다. 유사분열 추출물을 생산하기 위해, 유사분열에서 노코다졸 1 ㎍/ml를 사용하여 18 시간 동안 섬유아세포를 동기화하고, 유사분열물을 진탕해내어 수확하고, 인산염 완충 염수로 2 회 및 세포 용해 완충액 (20 mM Hepes, pH 8.2, 5 mM MgCl 2 , 10 mM EDTA, 1 mM DTT 및 프로테아제 억제제)에서 1 회 세척하였다. 침강된 세포를 1 부피의 빙냉 세포 용해 완충액에서 재현탁하여, 빙상에서 1 시간 동안 팽윤시키고, 딱 맞는 유리 막자를 이용하여 다운스-균질화시켰다. 용해물을 15 분 동안 15,000 xg 및 4 ℃에서 원심분리하고, 상등액 (유사분열 추출물)을 분취하고, 액체 질소에서 동결시키고, -80 ℃에서 저장하였다. 새로운 또는 동결된 추출물을 핵 파괴의 효율에 대한 현저한 차이 없이 사용하였다.
전면생장 배양물로부터의 소과 동물 태아 섬유아세포를 Ca 2+ /Mg 2+ -무함유 행크 균형 염 용액 (HBSS)으로 세척하고, 대략 38.5 ℃의 H 2 O 욕조 내에서 HBSS 100 ㎕ 중에 31.2 U 스트렙토리신 O (SLO; 시그마)를 갖는 현탁액에서 100,000 세포를 30 분 동안 인큐베이션함으로써 투과가능하게 하였다. 투과가능화를 막 비투과 DNA 염색제인 요오드화프로피듐 (0.1 ㎍/ml)의 흡수에 의해 평가하였다. 투과가능해진 섬유아세포를 침강시키고, 세척하고, ATP-생산 시스템 (1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 포스페이트 및 25 ㎍/ml 크레아틴 키나제)을 함유한 유사분열 추출물 40 ㎕에서 30-45 분 동안 대략 38.5 ℃에서 인큐베이션하여 핵 해체 및 핵 성분의 제거를 촉진하였다. 분취물을 0.1 ㎍/ml 획스트 33342로 표지화시켜 염색질 응축을 모니터링하였다. 인큐베이션한 후에, 섬유아세포를 침강에 의해 추출물로부터 회수하고, 세척하였다. 막 재밀봉을 위해 2 mM CaCl 2 를 함유한 알파 MEM/10％ 소과 동물 태아 혈청 (기브코-BRL) 500 ㎕로 반응 혼합물을 희석하고, 세포를 2 시간 동안 38.5 ℃에서 배양하였다 [Hakelien et al., Nat. Biotechnol. 20:460-466, 2002]. 재밀봉을 요오드화프로피듐 흡수로 모니터링하였다. 재밀봉된 세포를 20 hpm에서 핵제거된 시험관내-성숙 난모세포와 융합하고; 난모세포를 28 hpm에서 활성화하고, NT에 대해 실시예 10에 기재한 바와 같이 배아를 배양하였다.
SLOT 배아를 포배 단계로 시험관내 배양하고, 수용체 암컷 당 2 배아를 전달하였다. 임신을 초음파진단으로 모니터링하고, C-섹션을 수행하였다. 송아지를 출생 24 시간 내에 수의사가 채점하였다.
유사분열 추출물에서의 섬유아세포 핵의 파괴
유사분열 추출물은 유사분열 소과 동물 섬유아세포의 용해물로부터의 15,000 xg 상등액으로 이루어지고, ATP-재생산 시스템을 함유하였다. 추출물은 아폽토시스를 유도하지 않았으며, 이는 폴리(ADP)리보실 중합효소 (PARP)의 단백질가수분해의 부재 및 아폽토시스 섬유아세포의 특징인 DNA 단편화에 의해 판단하였다 (도 49A). 따라서, 추출물은 체세포 핵의 리모델링을 촉진하는데 적합하였다.
추출물은 염색체의 ATP-의존 응축, 염색질로부터의 A/C 및 B 형 라민의 해체 (이는 상기 라민의 세포질 표지화로 결정함) 및 염색질로부터의 TBP의 제거를 유도하였다 (도 49B). 이들 현상을 유사분열 추출물로부터의 회수 후에 섬유아세포로부터 정제된 응축된 염색질의 이뮤노블롯팅 분석으로 확인하였다 (도 49C; 레인 1 및 3 비교). 이 실험에서, 유사분열에서 보통 일어나는 바와 같이, 응축된 염색체와 결합한 채로 있는 핵 성분의 마커로서 A-키나제 앵커링 단백질 AKAP95를 사용하였다 [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999]. 히스톤 H4를 겔 중의 단백질 로딩 대조군으로서 사용하였다 (도 49C). 유사분열 추출물 중의 염색질로부터의 핵 라민 및 TBP의 해체는 ATP-재생 시스템에 따라 다르고 (도 49B 및 49C, 레인 3 및 4), 유사분열 세포에서 반복하여 일어난다 (도 49C, 레인 2). 또한, 유사분열 추출물에 대한 노출 후에 투과가능해진 전체 섬유아세포 (단리된 염색질과 반대임)의 이뮤노블롯팅 분석은 가용화된 라민 A/C 및 모든 검출가능한 TBP의 일부를 세포로부터 제거하고(하거나) 단백질가수분해하였다는 것을 나타냈다 (도 49C, 레인 6). 마지막으로, 간기 섬유아세포로부터의 대조군 추출물 (도 49C, 레인 5) 또는 세포 용해 완충액 (모두 ATP-재생산 시스템을 함유함) 단독으로는 핵 해체를 촉진하지 못하며, 이는 핵 파괴가 ATP-의존적이고 유사분열 추출물에 대해 특이적이라는 것을 나타내었다. 유사분열 추출물에 노출시키고 CaCl 2 로 재밀봉한 투과가능해진 섬유아세포를 수회 계대배양에 걸쳐 배양할 수 있으며, 막 투과가능화, 추출물에서의 투과가능해진 세포의 인큐베이션 및 막 재밀봉이 생존 절차이었음을 암시한다.
염색질 전달에 의해 생산한 배아 중의 핵의 특성화
수용체 난모세포에 대한 재밀봉된 섬유아세포의 융합은 비-투과가능해진 세포만큼 효율적으로 (70％ 초과) 일어났다. 난모세포 내로의 도입 시에 공여자 염색질은 응축된 형태이었다 (도 50A, SLOT). 대조적으로, NT에 대해 사용된 섬유아세포의 염색질은 융합 30 분 이내에 여전히 탈응축되었다 (도 50A, NT). 따라서, 난모세포 내로 전달하기 전에 CaCl 2 를 사용하는 유사분열 추출물-처리된 섬유아세포의 재밀봉은 공여자 세포에서 핵 재형성을 촉진하지 않았다. 이러한 관찰은 융합 직후에 SLOT 배아 중의 응축된 염색질 주위에 핵 외피의 부재에 의해 지지되었으며, 이는 몇몇의 라미나 및 핵막 내부 단백질의 면역형광 분석에 의해 결정하였다.
SLOT 및 NT 배아의 핵 중의 핵 라민 및 TBP의 면역표지화 및 DNA 형광 강도에 상대적인 이들 마커의 강도 면역표지화를 도 50B 및 50C에 나타내었다. 핵주위 라민 B 표지 강도는 SLOT 및 NT 전핵에서 유사하였다. 그러나, 놀랍게도, NT 전핵과 대조적으로, 라민 A/C는 전핵, 및 SLOT 배아에서 적어도 8-16-세포 단계 이하에서 검출되지 않았다 (도 50B). SLOT 전핵은 또한 NT 전핵에 비해 TBP 표지화의 4 배 감소를 나타냈다 (도 50C). 마우스에서의 전핵 TBP 농도는 간기를 통한 진행 동안 증가되는 것으로 나타났다 [Worrad et al., Development 120:2347-2357, 1994]. 그러나, PCC- 또는 시험관내-응축된 염색질로부터의 전핵 형성의 반응속도가 NT 및 SLOT 배아에서 유사했기 때문에, 비록 형식적으로 제외되지는 않지만, NT 전핵에서의 증가된 TBP 농도가 더 진행된 세포 주기 단계 때문이었던 것 같지는 않다. 1％ 트리톤 X-100, 1 mg/ml DNAse I, 및 0.3 M NaCl을 사용한 추출에 대한 TBP의 내성은 2 배 넘게 감소하였으며 (도 50D), 이는 TBP와 핵내부 리간드와의 약한 결합을 나타낸다. 마찬가지로, DNAse I에 대한 DNA의 내성은 SLOT 전핵에서 거의 4 배 감소하였으며, 이는 SLOT가 전핵에서 느슨한 염색질 형태가 확립되도록 촉진한다는 것을 제안한다 (도 50D). 따라서, 유사분열 추출물 중의 섬유아세포 핵의 해체에 이어서 응축된 염색질의 난모세포로의 전달은 공여자 핵의 형태적 리모델링을 증가시키고, NT 배아의 전핵에서 검출되는 결함을 완화시켰다.
건강한 클론을 생산하는 염색질 전달
SLOT는 클로닝된 배아를 일정 기간 동안 발육시켰다 (도 51A 및 51B). 수용체 암컷 내로의 포배 전달 후의 임신율은 NT 배아보다 SLOT 배아에 대해 제40일에 유의하게 더 높았고 (P=0.02; 피셔 테스트), 이 경향을 일정 기간의 발육까지 유지하였다 (송아지 출생, 각각 12/59 및 23/211; P=0.05) (도 51A). 또한, SLOT는 출산 24 시간 초과 후의 클론의 생존율을 증대시켰다 (각각 10/59 및 17/211; P=0.04) (도 51A 및 51B).
출생한 NT (실시예 10) 및 SLOT 클론의 건강을 1 (정상) 내지 5 (크게 비정상)의 척도를 기준으로 동물 및 태반을 채점하여 평가하였다. 태반 점수는 파라미터, 예컨대 태반 부종, 자엽 수, 크기 및 형태, 양막 유체의 색, 자궁 형태 및 배꼽을 포함한다. 동물 점수는 호흡기, 심혈관계, 소화기, 비뇨기, 근육, 골격 및 신경계의 기능적 평가 및 일반적 외형을 포함한다. 각 송아지에 대한 데이타를 도 51에 나타내었다. 박스 플롯 분석은 NT로부터 유도된 동물 및 태반의 점수가 SLOT에 의해 생성된 것보다 더 분산되어 있음을 나타낸다 (도 51E). SLOT 및 NT 클론의 평균 출생 체중은 유의하게 다르지 않았지만; 출생시에 45 kg 초과의 SLOT 송아지의 비율이 NT 동물보다 더 낮았다 (P=0.02; 피셔) (도 51D 및 51E). 요컨대, 이들 결과는 염색질 전달이 생존 자손을 생산하고, 개선된 발육 및 생존능을 보여준다는 것을 나타낸다.
NT와 비교(실시예 10)에서 생산된 SLOT 자손의 제한된 수 (n=8)에도 불구하고 SLOT는 제40일의 임신율 (P=0.02) 및 출생 24 시간 초과 후의 송아지 생존율 (P=0.04)을 유의하게 증대시킨다. SLOT에 의해 생산된 동물의 건강 개선에 대한 경향은 박스 플롯 분석에서도 반영된다. 또한, SLOT에 의해 생산되는 큰 (45 kg 초과) 송아지의 더 낮은 발생율은 동물 관리상의 실무 및 경제적 관련성을 갖는다.
라민 A/C의 조립, 전핵 TBP 함량의 증대 및 DNAse I에 대한 DNA의 내성 증가를 비롯한 몇몇 핵 결점을 NT 배아에서 확인하였다. 이들 결점은 섬유아세포 핵의 불완전한 리모델링 및(또는) 분화된 세포-특이적 (예컨대, 라민 A) 유전자 발현의 조절 오류로부터 발생될 수 있다. 핵의 시험관내 리모델링 및 응축된 염색질의 난모세포로의 이식은 이들 결점을 경감시킨다.
SLOT를 통한 핵 리모델링은 DNAse I에 대한 DNA의 감수성을 증가시키고, 전사 활성 (또는 잠재적으로 활성인) 염색질의 형성을 촉진할 수 있다. 이 효과는 발생적으로 중요한 유전자, 예컨대 태반 발생, 임신 말기의 유지 및 출생후 생존과 관련된 유전자의 발현을 촉진시킬 수도 있다. SLOT는 또한 클로닝된 배아 중의 라민 A 유전자 발현의 저해를 유도한다. 핵 라미나 조성물의 시험관내 및 생체내 조작은 올바른 세트의 라민의 조립 실패가 변함없이 아폽토시스를 유도한다는 것을 보여주었다 [Steen et al., J. Cell Biol. 153:621-626, 2001]. 또한, 라민이 DNA, 염색질 및 전사 기구와 상호작용하기 때문에, 적절한 라미나 재구성은 클로닝된 배아 중의 정상 핵 기능에 필수적인 것으로 여겨진다 [Gruenbaum et al., J. Struct. Biol. 129:313-323, 2000 and Cohen et al., Trends Biochem. Sci. 26:41-47, 2001].
유사분열시 또는 시험관내 염색질 응축은 DNA-결합 성분, 예컨대 염색질 리모델링 효소, 전사 인자 (예컨대, TBP) 또는 다른 잠재적 억제성 체세포 성분의 유리와 관련된다. 공여자 체세포 염색질로부터의 TBP의 제거는 SLOT 배아의 체세포-특이적 유전자의 억제 또는 하향-조절을 촉진할 수 있으며, 이는 발육을 저해할 수 있다. 공여자 핵으로부터의 인자의 제거는 염색질 상으로의 모계 성분의 로딩 및 이후 생리적 전핵으로의 리모델링이 촉진될 수 있음을 암시한다.
결론적으로, 세포 추출물 중의 체세포 핵을 직접 리모델링하고, 생존 자손을 생산할 수 있다. 클로닝 또는 트랜스분화 목적을 위한 핵의 시험관내 조작 [Landsverk et al., EMBO Rep. 3:384-389, 2002 and Hakelien et al., Nat. Biotechnol. 20:460-466, 2002]은 핵 리프로그래밍 메카니즘의 임의의 추가 조사에 유용한 도구이다. 염색질 전달은 클론의 일정 기간의 개선된 발육 및 생존능의 증거를 보여준다. 시스템의 추가의 조작은 포유동물 클로닝 효율에서의 추가 개선을 유도할 수 있다.
실시예 17: 스트렙토리신 0-전달 (SLOT)을 사용하는 더 완전한 핵 리프로그래밍에 대한 추가의 증거
실시예 12에 기재한 SLOT 방법은 공여자 투과가능해진 세포를 유전자 전달 전에 재밀봉하지 않는 경우에 개선된 결과를 얻었다. 또한, 전면생장 세포 대신에 G 1 단계에서의 공여자 세포의 사용은 재구성된 난모세포 및 생성된 배아의 생존능을 증가시킬 수 있다. 이들 실험을 하기에 추가로 기재한다.
완충액의 제조
H 2 O 1 ml를 에펜도르프 (eppendorf) 튜브 중에 두고, 냉각된 DTT 154 mg을 첨가하고, 볼텍싱으로 잘 혼합하여 1 몰 DTT 용액을 제조하였다. 용액을 10 ㎕ 부피로 분취하고, -20 ℃에서 동결시켰다. 분취물을 해동시키고, 수회 재동결시켰다. 핵 조립/해체 분석에서 세포 추출물을 제조하기 위한 100 ml 부피의 세포 용해 완충액은 NaCl (50 mM, 5 M 원액 1 ml), MgCl 2 (5 mM, 1 M 원액 0.5 ml), Hepes, pH 8.2 (20 mM, 1 M 원액 2 ml, pH 8.2) 및 H 2 O (96.5 ml)를 함유하였다. 완충액을 분취하고, 4 ℃에서 저장하였다. 용해물 제조시에 pH 약 1 단위에 1 방울이었다. 유사분열 추출물을 제조하기 위해, 10 mM EGTA (1 M 원액 1 ml)를 첨가하고, H 2 O 95.5 ml를 96.5 ml 대신에 첨가하였다. 사용하기 전에, 하기를 첨가하였다: DTT (용액 1 ㎕/ml, -20 ℃의 1 M 원액, 1 mM 최종 농도), PMSF (용액 10 ㎕/ml, 100 mM 원액, 1 mM 최종 농도), CAL 혼합물 (용액 1 ml 당 -20 ℃의 CAL 칵테일 10 ㎕, 즉 키모스타틴, 아프로티닌 및 류펩틴 각각의 최종 농도가 10 ㎍/ml임), 펩스타틴 A (용액 1 ml 당 -20 ℃의 원액 10 ㎕, 최종 농도 10 ㎍/ml) 및 사이토칼라신 D (-20 ℃의 1 mg/ml 원액으로부터의 1 ㎕/ml, 최종 농도 1 ㎍/ml). 노코도졸 1000 X 원액의 경우, DMSO 중의 1 mg/ml 노코도졸을 제조하고, 160 ㎕ 분취물로 저장하였다.
스트렙토리신 O 원액 (SLO)을 제조하기 위해, SLO의 1 바이알 (시그마 S-5265; 4 ℃에서 분말로서 저장하는 25,000 단위)을 H 2 O 400 ㎕에 용해시키고, 잘 혼합하였다. 전체 함량을 1.5 ml 원뿔 튜브로 옮기고, 10 ㎕ 분취물로 나누고, -20 ℃에서 동결시켰다. 원액 농도는 "10 X"이었다. 프로테아제 용액을 제조하기 위해, TL Hepes 3 ml 및 프로테아제 (시그마 P-8811) 9 mg을 15 ml 원뿔 튜브에 첨가하고, 볼텍싱으로 혼합하였다. 0.22 ㎛ 주사기 필터를 통해 용액을 직접적으로 TL Hepes 내로 여과하였다. 세포의 부피가 2 배가 되기 때문에, 최종 농도는 1.5 mg/ml이었다. HECM Hepes의 경우, NaCl (114 mM, 6.662 g), KCl (3.2 mM, 0.239 g), CaCl 2 2H 2 O (2.0 mM, 0.294 g), MgCl 2 6H 2 O (0.5 mM, 0.102 g), 펜/스트렙 (Pen/Strep) (10 ml, 시그마 P3539 펜/스트렙, 최종 농도 100 U/ml 및 100 ㎍/ml), 페놀 레드 (5 ㎍/ml, 1 ml) 및 H 2 O (990 ml로 총 부피를 증가시키기에 충분한 양 중에)를 합하였다. 이어서, 100 X AA (10 ml), Na 락테이트 (10 mM, 1.44 ml), Na 피루베이트 (0.1 mM, 0.011 g), NaHCO 3 (2 mM, 0.168 g) 및 HEPES (10 mM, 2.38 g)를 첨가하였다. 최종 용액의 삼투몰농도는 260-270 mOsM이었다. 이어서, 소과 동물 혈청 알부민 (분취물 V) 3 g을 첨가하고, pH를 7.4로 조정하였다. 용액을 0.22 μM 필터를 통해 여과하고, 4 ℃에서 저장하였다.
ATP 원액 (시그마 A3377: 100 mM 원액, 100 x)의 제조를 위해, H 2 O (1 ml) 및 ATP (0.055 g)를 합하고, 분취물 10 ㎕를 -20 ℃에서 동결시켰다. 크레아틴 포스페이트 (시그마 P7936: 1 M 원액, 100 x)를 제조하기 위해, H 2 O (1 ml) 및 크레아틴 포스페이트 (0.255 g)를 합하고, 분취물 10 ㎕를 -20 ℃에서 동결시켰다. 크레아틴 키나제 (시그마 C3755: 원액 2.5 mg/ml, 100 x)를 제조하기 위해, H 2 O (1 ml) 및 크레아틴 키나제 (0.0025 g)를 합하고, 분취물 10 ㎕를 -20 ℃에서 동결시켰다. ATP-생산 시스템을 제조하기 위해, 동일 비율의 100 mM ATP 원액, 1 M 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나제 원액 (100 x) 2.5 mg/ml를 H 2 O를 사용하여 제조하고, 혼합하고, 동결 용액으로서 저장하였다. ATP 생산 시스템을 빙상에서 사용할 때까지 유지하였다. ATP 생산 시스템 (1.2 ㎕)을 추출물 (40 ㎕)에 첨가하고, 용액을 볼텍싱으로 혼합하였다. 추출물 중의 ATP 생산 시스템의 최종 농도는 1 mM ATP, 10 mM 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나제 25 ㎍/ml이었다.
유사분열 추출물의 제조
1.5 내지 2 백만 세포의 1 바이알을 해동시켰다. 세포를 2 개의 T75 플라스크로 나누고, 2 일 동안 또는 전면생장될 때까지 성장시켰다. 세포를 6-8 개의 T75 플라스크 내에서 계대배양하고, 전면생장으로 성장시켰다. 세포를 트립신 처리하고, 혈구계수기를 이용하여 계수하고, 3 백만 세포를 입수가능한 세포 수를 사용할 수 있는 만큼 많이 T150 플라스크 각각에 첨가하였다. 표준 방법을 이용하여 노코다졸 0.5-1 ㎍/ml를 사용하여 17-20 시간 동안 유사분열 중에 70-80％ 전면생장에서 세포주 (예컨대, 섬유아세포, 예컨대 1차 섬유아세포, 상피 세포 또는 고정화되고 질환이 없는 세포, 예컨대 MDBK 세포)를 동기화하였다 (예컨대, [Collas et al., J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999] 및 본원의 참조문헌). 동기화된 세포를 유사분열을 진탕해내어 수확하였다. 한 손으로 플라스크를 반복적으로 가볍게 쳐서 세포를 함유한 플라스크 각각을 격렬하게 진탕하였다. 유사분열 세포를 분리하고, 배양 배지에 부유시켰다. 수확한 세포를 50 ml 원뿔 튜브 내에서 10 분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿을 총 50 ml의 냉각 인산염 완충 염수/Ca/Mg 무함유 (PBS)에 재현탁하였다. 필요에 따라, 몇몇의 세포 펠릿을 단일 50 ml 튜브 내로 취합할 수 있다. 세포를 10 분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 원심분리하고, 상기 세척 단계를 반복하였다. 세포 펠릿의 부피를 측정하고, 세포 펠릿을 프로테아제 억제제 (즉, DTT 및 PMSF)를 함유한 대략 20 부피의 빙냉 세포 용해 완충액에 재현탁하였다.
이어서, 세포를 5 분 동안 4 ℃ 및 500 xg에서 침강시켰다. 상등액을 제거하고, 세포 펠릿 부피를 측정하였다. 모든 프로테아제 억제제를 함유한 1 부피 미만의 세포 용해 완충액에 세포 펠릿을 재현탁하였다. 세포를 빙상에서 1 시간 동안 인큐베이션하여 세포를 팽윤시켰다. 팁 초음파분해기를 이용하여, 모든 세포가 파괴되어 개봉될 때까지 세포 현탁액을 초음파분해하였다. 세포 용해물을 위상차 현미경 하에 모니터링하였다. 바람직하게는, 다음 단계 진행 전에 90％의 세포를 용해시켰다. 초음파분해를 필요한 만큼 길게 연장할 수 있는데; 초음파분해 시간은 추출물의 제조에 사용하는 세포 유형에 따라 다르다. 별법으로는, 유리 막자사발 및 막자 (균질화기)를 이용하여 다운스 균질화에 의해 세포를 바람직하게는 90％ 이상의 세포가 용해될 때까지 용해시킨다. 세포 용해물을 1.5 ml 원심분리기 튜브 내에 두고, 테이블 탑 냉각 원심분리기를 이용하여 15 분 동안 4 ℃ 및 약 15,000 xg에서 원심분리하였다. 원심분리기를 냉각실 또는 냉각장치 내에 두고, 평형화시켰다. 튜브를 원심분리기로부터 들어내고, 즉시 빙상에 두었다. 200 ㎕ 피펫 팁을 이용하여 상등액을 조심스럽게 수거하였다. 이 상등액은 유사분열 세포질 추출물이다. 추출물을 빙상의 또 다른 튜브 내에 두었다. 수개의 튜브로부터 수거한 추출물을 취합했다.
두가지 다른 방법이 이 단계에 있다. 세포 추출물을 1 튜브 당 추출물 41 ㎕로 빙상의 튜브 내로 분취하였다. 추출물을 액체 질소 중에서 즉시 순간-동결하고, 사용할 때까지 -80 ℃ 냉동장치에 저장하였다. 15,000 xg 원심분리로부터 제조한 이러한 추출물을 MS15 (또는 유사분열 세포질 추출물)이라 칭한다. 별법으로는, MS15 추출물을 빙상의 초원심분리기 튜브 (예컨대, SW55 Ti 로터용; 베크만) 내에 두었다. 필요에 따라, 초원심분리시에 튜브의 파손을 차단하기 위해 튜브 상부를 광유로 오버레이한다. 추출물을 3 시간 동안 4 ℃ 및 200,000 xg에서 원심분리하여 MS15에 함유된 막 소포를 침강시켰다. 원심분리 말기에, 오일을 제거하였다. 상등액을 조심스럽게 수거하고, 빙상의 1.5 ml 냉각 튜브 내에 두었다. 필요에 따라 몇몇의 상등액을 사용하였다. 이 상등액을 MS200 (또는 유사분열 세포질 추출물)로서 칭한다. MS15 추출물에 대해 기재한 바와 같이 MS200 추출물을 분취하고, 동결시켰다.
염색질 전달
클로닝 절차 전날에, 1 개의 35 mm 넌크 (Nunc)를 1 백만 섬유아세포로 제조하거나 또는 500,000 세포를 함유한 6 개의 T75 플라스크를 진탕용으로 제조하였다. 클로닝 절차의 오전에 모든 플라스크 내에 방사선조사 15％ FBS를 갖는 알파 MEM, 완전 배지를 바꾸어 파편 및 사멸 세포를 제거하였다. 투과가능화 및 유사분열 추출물 반응을 수행하기 전에, SLO 원액을 순차 희석 (예컨대, 1 X, 0.5 X, 0.3 X 및 0.1 X의 희석)하고, 수조 내에서 30 분 동안 대략 38.5 ℃에서 인큐베이션하고, 이어서 요오드화프로피듐으로 염색함으로써 80-90％ 세포의 투과가능화에 요구되는 SLO의 최소 농도를 측정하였다.
트립신 또는 세포 분리 완충액을 사용하여 세포를 전면생장 배양 또는 새롭게 형질감염된 세포 배양으로부터 분리하고, 15 ml 원뿔 튜브 내에 두고, 행크 균형 염 용액, Ca/Mg 무함유 (HBSS)를 사용하여 원심분리로 1 회 세척하였다. 세포 펠릿을 1 ml HBSS에 재현탁하고, 세포를 계수하여 농도를 측정하였다. 대략 50,000-100,000 세포를 실온에서 HBSS (기브코 BRL, 카탈로그 제14170-120호) 100 ㎕에서 현탁하였다. SLO 원액 5 ㎕를 미리 측정한 농도로 첨가하였다. 혼합물을 수조 내에서 대략 38.5 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 튜브를 인큐베이션 동안 완만하게 2-3 회 가볍게 쳐서 확실하게 세포가 현탁액에 남아 있게 하였다. 200 ㎕ 부피의 실온 PBS (Ca/Mg 무함유)를 첨가하고, 완만한 피펫팅으로 잘 혼합하였다. 세포를 테이블 탑 원심분리기 내에서 5 분 동안 실온 및 500 xg에서 원심분리하였다. 모든 상등액을 제거하였다. 펠릿은 작고, 뚜렷하게 가시화되지는 않았다.
ATP-생산 시스템을 함유한 40 ㎕ 부피의 유사분열 추출물을 첨가하고, 용액을 잘 혼합하였다. 추출물을 상기 30 분 인큐베이션 동안 제조하였다. 추출물 40 ㎕의 1 바이알을 해동하고, ATP-생산 시스템 1.2 ㎕에 첨가하였다. 용액을 잘 혼합하고, 실온에서 유지하였다. 혼합물을 수조 내에서 38.5 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 튜브를 때때로 완만하게 가볍게 쳤다. 500 ㎕ 부피의 실온 완전 배지 (알파 MEM + 15％ 송아지 태아 혈청)를 첨가하고, 사용할 때까지 개봉 뚜껑이 장착된 대략 38.5 ℃ 인큐베이터에 저장하였다. 세포를 테이블 탑 원심분리기 내에서 5 분 동안 실온 및 500 xg에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 실온 TL Hepes 1 ml에 재현탁하고, 15 ml 원뿔 튜브 내로 옮겼다. TL Hepes (여과함) 중의 1 ml 부피의 프로테아제 3 mg/ml를 세포에 대한 최종 프로테아제 농도가 1.5 mg/ml가 되도록 첨가하고, 혼합물을 30 초 동안 인큐베이션하였다. TL Hepes를 첨가하여 15 ml 원뿔 튜브를 충전하고, 튜브 뚜겅을 덮고, 2300 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. TL Hepes를 세포로부터 제거하고, TL Hepes 150 ㎕를 세포에 첨가하였다. 튜브를 적절한 세포주에 대해 표지화하고, 가온 단계에 두었다.
세포를 제조하는 동안 적절한 크기의 세포 전달 피펫을 이용하여 세포를 전달하기 위해 조작 스테이션을 제조하였다. 핵제거된 대략 50 난모세포를 100 mm 디쉬 내에 중광유 하의 50 ㎕ 액적의 TL Hepes 내에 두었다. 세척한 세포를 핵제거된 난모세포와 함께 1 방울 중에 두었다. 모든 난모세포로 유전자 전달을 위해 충분한 세포를 사용하였다. 조작 기구를 입체적으로 블로킹할 만큼 많은 세포를 조심스럽게 사용하였다. 하나의 핵제거된 난모세포를 홀더 상에 두고, 하나의 세포를 투명대 하의 난황주위 공간에 두어 세포가 난모세포의 원형질막과 접촉하게 하였다. 융합을 촉진하기 위해, 세포를 극체에 인접하게 또는 반대편에 두었다. 모든 핵제거된 난모세포가 그들에게 전달된 세포를 가진 후에, 난모세포를 미세액적으로부터 제거하고, 융합을 위해 예비-가온 35 mm 디쉬의 HECM Hepes에 두었다.
결과
유전자 전달 전에 막을 재밀봉하지 않은 공여자 세포에 대한 하기 표 12의 결과와 유전자 전달 전에 막을 재밀봉한 공여자 세포에 대한 표 11의 결과와의 비교는 증가된 클로닝 효율이 투과가능해진 세포막의 재밀봉하지 않은 것에 의해 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 표 12는 전면생장 세포 대신에 G 1 단계의 공여자 세포를 사용하는 것이 재구성된 난모세포 및 생성된 배아의 생존능을 증가시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 표 11의 데이타는 소과 동물 1차 섬유아세포 및 공여자 소과 동물 태아 섬유아세포로부터의 추출물을 사용하여 얻었다. 또한, MDBK 세포를 사용하여 성공적으로 리프로그래밍 추출물을 생산하였다.
실시예 18: 키메라 포유동물의 생성 방법
포유동물을 클로닝하는 전통적인 방법을 이용하는 경우에 발생하는 빈번한 자발 낙태는 태아가 지닌 문제점이라기보다는 태반의 이상으로부터 기인하는 것으로 생각된다. 따라서, 태반 조직은 주로 한 기원으로부터 유래하고 (예를 들어, 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아) 태아 조직은 주로 다른 기원으로부터 유래한 (예를 들어, 이종 항체를 코딩하는 핵 전달 배아) 키메라 배아를 제조하기 위한 방법이 개발되었다. 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아로부터의 세포에서 주로 유래한 태반 조직을 갖는 키메라 배아는 자연 발생 태반 조직과 더 닮아서 생존가능한 자손의 출산율을 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 자손의 대부분의 세포가 핵 전달 배아로부터의 세포에서 유래하기 때문에, 상기 세포의 게놈은 핵 전달 배아를 생성하기 위해 사용된 공여자 세포의 게놈과 실질적으로 동일하다.
상기와 같은 한 방법에서, 시험관내 수정된 배아로부터의 세포는, 전통적인 핵 전달 방법 또는 본원에 기재된 임의의 기타 클로닝 방법을 이용하여 제조된 이종 항체를 코딩하는 밀집 배아의 주변 (예를 들어, 배아 그 자체와 투명대 사이)으로 주입된다. 별법으로, 밀집전 상태의 시험관내 수정된 배아로부터의 세포를, 각 배아로부터의 세포가 재구성되어 단일 키메라 배아를 생성하도록 하는 조건하에서 본 발명의 클로닝 방법 중 하나를 이용 (예를 들어, 공여자 공급원으로서 리프로그래밍된 염색질 덩어리 또는 투과가능해진 세포를 이용)하여 제조된 이종 항체를 코딩하는 밀집전 배아로부터의 세포와 함께 배양한다 [Wells and Powell, Cloning 2:9-22, 2000]. 상기 두가지 방법에서, 시험관내 수정된 배아로부터의 세포는 우선적으로 태반에 혼입되고, 핵 전달 방법으로부터의 세포는 우선적으로 태아 조직에 혼입된다. 이들 방법은 이하에 추가로 설명한다. 그 결과는 이종 항체 유전자를 함유하지 않는 핵 전달 배아를 사용하여 생성되었지만, 이종 항체 유전자를 함유하고(거나) 프리온 유전자에서 돌연변이를 함유하는 핵 전달 배아에 대해서도 유사한 결과가 기대된다.
G1 섬유아세포의 단리
핵 전달 배아를 제조하기 위한 공여자 세포로서의 G1 섬유아세포를 단리하기 위해, 앞서 기재된 "진탕 분리" 방법을 이용하였다 [Kasinathan et al., Nature biotech. 19:1176-1178, 2001]. 요컨대, 단리 24시간 전에 5.0×10 5 개의 세포를, α-MEM + FCS 10 ml을 함유하는 100 mm 조직 배양 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날에, 플레이트를 PBS로 세척하고, 배양 배지를 단리 1 내지 2시간 전에 교체하였다. 이어서, 플레이트를 볼텍스-제니 2 (Vortex-Genie 2; Fisher Scientific, Houston, TX, 중간 속도)에서 30 내지 60초 동안 진탕하였다. 배지를 제거하고, 500 xg로 5분 동안 원심분리한 후, 펠릿을 MEM + FCS 250 ㎕에 재현탁하였다. 세포 현탁액은 세포질 브릿지에 의해 부착된, 새로이 분열된 세포 쌍; 몇몇 단일 세포; 및 중기 또는 후기 세포로 이루어져 있었다. 세포질 브릿지에 의해 부착된 세포 쌍을 핵 전달용 공여자 세포로서 사용하였다.
핵 이식, 활성화 및 배아 배양
본질적으로 앞서 기재된 바와 같이 G1 섬유아세포를 사용하여 핵 전달 방법을 수행하였다 [Cibelli et al., Nature Biotech. 16(7):642-646, 1998; Kasinathan et al., Biol. Reprod. 64(5):1487-1493, 2000]. 시험관내에서 성숙된 난모세포를 성숙한지 약 18 내지 20시간 후에 핵을 제거하고, 염색체 제거를 UV광 하에서 비스벤즈이미드 (획스트 33342, Sigma) 표지에 의해 확인하였다. 이들 세포질체-공여자 세포 쌍을, 20 μ초 동안 2.4 kV/cm의 단일 전기 펄스 (Electrocell manipulator 200; Genetronics, San Diego, CA)를 사용하여 융합시켰다. 성숙 30 시간 후, 앞서 기재된 바와 같이 [Liu et al., Mol. Repro. Dev. 49:298-307, 1998; Presicce et al., Mol. Reprod. Dev. 38:380-385, 1994] 칼슘 이오노포어 (5 μM)를 사용하여 4분 동안 (Cal Biochem, San Diego, CA) 처리하고, ACM 배양 배지 (100 mM NaCl, 3 mM KCl, 0.27 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM 나트륨 락테이트, 0.4 mM 피루베이트, 1 mM L-글루타민, 3 mg/ml BSA (지방산 무함유), 1％ BME 아미노산 및 1％ MEM 비필수 아미노산; 모두 Sigma 제품) 중의 10 ㎍ 시클로헥스이미드 및 2.5 ㎍ 사이토칼라신 D (Sigma)로 6시간 동안 재구성된 난모세포 및 대조군을 활성화시켰다. 활성화 후, 난자를 HEPES 용액으로 완충된 햄스터 배아 배양 배지 (HECM-HEPES, 114 mM NaCl, 3.2 mM KCl, 2 mM CaCl 2 , 10 mM 나트륨 락테이트, 0.1 mM 나트륨 피루베이트, 2 mM NaHCO 3 , 10 mM HEPES, 및 1％ BME 아미노산; Sigma)로 5회 세척한 후, 0.2 ml의 배아 시험된 미네랄오일 (Sigma)로 덮힌 0.5 ml의 배아 배양 배지 및 마우스 태아 섬유아세포를 함유하는 4-웰 조직 배양 플레이트에 넣었다. 각각의 웰에 25 내지 50개의 배아를 넣고, 공기 대기 중 5％ CO 2 에서 38.5℃로 인큐베이션하였다. 제4일에, 10％ FCS를 배양 배지에 첨가하였다. 제7일 및 제8일에, 포배 단계로의 진행이 기록되었다.
소과 동물의 시험관내 수정
소과 동물의 시험관내 수정된 배아 제조를 위해 앞서 기재된 바와 같이 [Collas et al., Mol. Reprod. Dev. 34:224-231, 1993] 시험관내 수정을 수행하였다. 정자 TL 원액을 사용하여 45％에서 90％의 등장성 퍼콜 (Percoll) 구배를 제조하였다 [Parrish et al., Theriogenology 24:537-549, 1985]. 단일 황소로부터의 동결-해동된 소과 동물 정자를 상기 구배의 위쪽에 올려놓고 700 xg로 30분 동안 원심분리하였다 (6.37 인치의 팁 반경을 이용하여 2000 rpm으로 원심분리). 펠릿 중의 정자 농도를 측정하고, 정자를 정자 TL (정자 TL 원액, 1 mM 피루베이트, 6 mg/ml BSA, 및 1％ PS)로 희석하여 수정시의 최종 농도가 10 6 개 정자/ml이 되도록 하였다. 성숙 22 시간 후, 난모세포를 TL HEPES 중에서 3회 세척하고, 6 mg/ml BSA, 0.2 mM 피루베이트, 20 μM 페니실아민, 10 μM 히포타우린, 1 mM 에피네페린 [Leibfried et al., J. Reprod. Fertil. 66:87-93, 1982] 및 0.004 ㎍/ml 헤파린을 함유하는 넌크 웰 중의 수정 TL [Bavister et al., Biol. Reprod. 28:235-247, 1983] 480 ㎕에 넣었다. 정자 20 ㎕를 첨가하여 난모세포 50개에 대하여 10 6 개 정자/ml의 최종 농도를 생성하였다. 배양 조건은 상기 핵 전달에 대해 기재한 것과 동일하였다. 수정율은 전핵 발생을 기준으로 90％가 넘었다.
키메라 핵 전달 배아
시험관내 수정된 8-세포 단계의 배아 (6 내지 12개의 할구)를 밀집되기 전, 수정 후 대략 96시간에 수집하였다. 프로테아제 (TL-HEPES 중 3 mg/ml)를 사용하여 투명대를 제거하였다. 해부 현미경을 이용하여 투명대의 용해를 조심스럽게 모니터링하였다. 투명대 용해가 처음으로 보일 때 (대략 2분), 배아를 분리하여 TL-HEPES로 세척하고, 행크 균형 염 용액 (Hank's balanced salt solution)을 함유하는 30 mm 페트리 접시로 옮겨 37.5℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이들 밀집전 배아로부터의 할구를 100 mm 페트리 접시에서 미네랄 오일 하의 TL-HEPES 미세액적 (50 ㎕)으로 옮겼다. 제4일에, 8 내지 16 세포 단계의 핵 전달 배아를 선별하여, 할구를 함유하는 동일한 미세액적으로 옮겼다. 이들 핵 전달 배아는 밀집전 배아 (예를 들어, 8 세포 단계의 배아)와 밀집 배아 (예를 들어, 16 세포 단계의 배아) 둘 다를 포함하였다. 이어서, 표준 미세조작 기술을 이용하여 경사 (beveled) 미세 피펫(직경 35 ㎛)으로 4 내지 6개의 할구를 핵 전달 배아로 옮겼다. 할구를 옮긴 후, 핵 전달 배아에 대해 기재된 바와 같이 배아를 배양하였다.
제7일 및 제8일에, 키메라 배아의 포배로의 발생을 평가하였다. 또한, 시험관내 수정된 배아로부터의 세포가 핵 전달 배아로 주입되기 전에 이들 세포에 첨가된 막 염료 DiI의 존재 여부에 대해 포배를 분석하였다. 세포를 제4일에 표지하고 제7일에 관찰하였다. 이 염료는 최초 염색된 세포의 자손에서 수차례 세포 분열 동안 유지되어 있었으며, 이로 인해 수차례 세포 분열 후에 키메라 배아를 분석할 수 있었다. 이 분석에 기초하여, 시험관내 수정된 배아로부터의 세포를 키메라 배아에 혼입시켰다. 필요한 경우, 시험관내 수정된 배아 또는 핵 전달 배아 중의 핵산에 특이적인 프로브를 사용한 형광 원위치 혼성화 (FISH; fluorescence in situ hybridization)를 표준 방법으로 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons, New Your, pp. 14.7.1-14.7.12, 1995] 참조). 이러한 FISH 분석은, 키메라 배아가 시험관내 및 태아에서 배양되거나 자손이 배아로부터 생성되는 동안, 키메라 배아에서 각 배아로부터 유래한 세포의 분포를 측정하기 위해 (예를 들어, 몇 ％의 세포가 내부 세포 덩어리에 혼입되고 몇 ％의 세포가 영양외배엽에 혼입되는지 측정하기 위해) 이용될 수 있다. 별법으로, 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 배아들 중 하나에서 유래한 세포에 첨가하여, 태반 및 키메라 배아의 다양한 태아 조직으로 세포가 혼입되는 것을 모니터링하는 데 이용할 수 있다.
배아 전달
제7일 및 제8일에, 핵 전달 배아 및 키메라 핵 전달 배아로부터 유래한 등급 1 및 2의 핵 전달 포배를 6일 및 7일 동기화된 수용자 어린 암소에 전달하였다. 수용자는 루탈리스 (Lutalyse; Pharmacia ＆ Upjohn, Kalamazoo, MI) 단일 주사 후의 발정기 검출을 이용하여 동기화하였다. 배아 전달 후 제30일 및 제60일에, 초음파검사로 수용자의 임신 여부를 조사하였으며, 이후 30일마다 직장내 촉진으로 제240일까지 검사하였다. 트랜스제닉 소과 동물의 섬유아세포를 난모세포와 융합시켜 제조된 대조군 배아 및 키메라 배아에 대해 제40일에 얻어진 임신을 표 13에서 비교하였다. 이 결과는 제40일까지 키메라 배아의 생존수가 더 많다는 것을 나타낸다.
키메라 배아의 제조를 위한 다른 방법
표준 방법을 이용하여 상기 언급한 키메라 배아 제조 방법을 변형할 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 배아를 포유동물 (예를 들어, 소과 동물)로부터 외과수술로 단리하거나, 또는 난모세포를 표준 기술을 이용하여 단성생식적으로 활성화시킴으로써 시험관내 수정된 배아 대신 사용할 수 있다. 필요한 경우, 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아로부터의 적은 수의 세포 (예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 세포)를 핵 전달 배아에 주입함으로써 주입된 세포 및 태아 조직으로 혼입되는 그 자손의 비율을 감소시킬 수 있다. 별법으로, 보다 많은 수의 세포 (예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11개 또는 그보다 많은 세포)를 주입함으로써 주입된 세포 및 태반 조직으로 혼입되는 그 자손의 비율을 증가시킬 수 있다. 또한, 다른 세포 단계의 배아로부터 유래한 세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 또는 그 이후 세포 단계의 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아를, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 또는 그 이후 세포 단계의 핵 전달 배아로 주입할 수 있다. 주입된 세포 및 핵 전달 배아는 동일한 세포 단계일 수도, 또는 상이한 세포 단계일 수도 있다. 한 실시양태에서, 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식적으로 활성화된 배아는 배수성 (ploidy)이 핵 전달 배아보다 높은 상태 (예를 들어, 4n의 DNA 함량)이고, 이는 영양외배엽 (즉, 주로 태반 조직을 형성하는 배아의 최외각 세포층)으로 주입된 세포의 경우에 배수성의 차이가 더 크다. 필요한 경우, 투명대의 전부 또는 일부가 주입 전에 제거되지 않고 주입된 세포 주변에 유지될 수 있다.
다른 방법에서는, 밀집전 또는 밀집 상태의 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식 배아로부터 유래한 세포를 밀집전 핵 전달 배아로부터의 세포와 함께, 각 배아로부터의 세포가 재구성되어 단일 키메라 배아를 생성하도록 하는 조건하에서 인큐베이션한다 [Wells and Powell, Cloning 2:9-22, 2000]. 시험관내 수정된 배아, 자연 발생 배아 또는 단성생식 배아로부터의 세포는 주로 영양외배엽에 기여하여 궁극적으로 태반 조직에 기여할 것으로 예상되고, 핵 전달 배아로부터의 세포는 주로 내부 세포 덩어리에 기여하여 궁극적으로 태아 조직에 기여할 것으로 예상된다. 상기 두 배아로부터의 세포는 동일한 세포 단계일 수도, 또는 상이한 세포 단계일 수도 있으며, 각 배아로부터의 동일하거나 상이한 수의 세포가 합해져서 응집 (aggregation) 배아를 형성할 수도 있다.
필요한 경우, 생성된 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포는 제2 라운드의 핵 전달에 사용되어 추가의 클로닝된 자손을 생성할 수 있다. 최초의 클로닝된 태아 또는 클로닝된 자손으로부터의 세포는 또한 동결되어, 추가의 클로닝된 유제동물의 생성을 위한 공여자 세포의 공급원으로서 사용되는 세포주를 형성할 수 있다.
실시예 19: 인간 Ig 발현에 대한 시험
HAC 또는 외인성 항체를 코딩하는 다른 핵산을 보유하는 소의 시험은 출생 직후부터 시작할 수 있으며, (1) 외인성 Ig 발현, (2) 면역화에 대한 반응, (3) 친화도 성숙, 및 (4) 자손으로의 HAC 유전에 대한 평가를 포함한다.
인간 Ig 발현은 동물의 혈액을 채취하여 ELISA, RT-PCR 또는 FACS 분석에 의해 인간 중쇄 및 경쇄 발현 여부를 분석함으로써 모니터링하였다 (예를 들어, PCT 공보 WO 01/35735 참조). 우선 동물이 인간 Ig를 생성하는가 결정되면, 보조제 중에서 파상풍 톡소이드로 동물을 면역화시켰다. 동물을 면역화시킨 후에 일주일에 1회 혈액을 채취하여 ELISA 또는 FACS를 통해 항원에 대한 반응을 측정하고, 면역화시키기 전에 미리 채취한 혈액과 비교하였다. 최초의 면역화로부터 한 달 후에, 동물을 수성 형태의 항원으로 촉진시켰다. 추가자극한지 일주일 후에 동물의 혈액을 채취하여 ELISA 또는 FACS를 통해 항원에 대한 반응을 측정하고, 미리 채취한 혈액과 비교하였다. ELISA 또는 FACS 분석은 반응 역가 뿐만 아니라 생성된 중쇄 이소타입의 역가 대부분을 측정할 수 있도록 한다. 이 데이터는 항체 역가의 증가 뿐만 아니라 클래스 스위칭 발생을 측정할 수 있도록 한다. 평균 친화도 추정치는 또한 항원에 대해 반응하는 동안 친화도 성숙이 일어나는지의 여부를 결정하기 위해 측정하였다.
트랜스제닉 소과 동물을 상기 기재된 바와 같이 수득한 후에, 이를 사용하여 트랜스제닉 Ig (바람직하게는, 인간이지만, 다른 종, 예를 들어 개, 고양이, 인간이 아닌 영장류, 양, 돼지, 염소와 같은 다른 유제동물, 마우스, 래트와 같은 쥐과 동물, 기니아 피그, 토끼 등도 가능함)을 생산한다. 언급한 바와 같이, Ig 유전자는 종간에 보존되어 있는 것으로 알려져 있다.
트랜스제닉 항혈청, 및 이종 항체 함유 젖
소과 동물 (또는 다른 유제동물)은 내생적으로 노출된 항원, 또는 외생적으로 투여된 항원이 무엇인지에 따라 달라지는 트랜스제닉 항혈청을 생성한다. 예를 들어, 항원을 유제동물에게 투여하여 병원체 (예를 들어, 박테리아, 바이러스, 원생동물, 효모 또는 진균)와 같은 항원, 종양 항원, 수용체, 효소, 사이토카인 등을 비롯한 항원에 반응하는 바람직한 항체를 생성할 수 있다. 항체 생성용 병원체의 예로는 간염 바이러스 (예를 들어, C형 간염 바이러스), 면역결핍 바이러스 (예를 들어, HIV), 헤르페스 바이러스, 파르보바이러스, 엔테로바이러스, 에볼라 바이러스, 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 백신 바이러스, 스트렙토코쿠스 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 뉴모니아 ( Streptococcus pneumoniae ), 헤마필루스 (예를 들어, 헤모필루스 인플루엔자; Haemophilus influenza ), 네이세리아 (예를 들어, 네이세리아 메닝기티스; Neisseria meningitis ), 코리네박테리움 디프테리아 ( Coryunebacterium diptheriae ), 헤모필루스 (예를 들어, 헤모필루스 페르투시아; Haemophilus pertussis ), 클로스트리디움 (예를 들어, 클로스트리디움 보툴리니움; Clostridium botulinium ), 스타플로코쿠스, 슈도모나스 (예를 들어, 슈도모나스 에어루기노사; Pseudomonas aeruginosa ) 및 호흡기 세포융� �� 바이러스 (RSV)가 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
하나 이상의 병원체를 트랜스제닉 유제동물에게 투여하여 특정 질환의 예방, 안정화 또는 치료에 유용한 과다면역 혈청을 생성할 수 있다. 예를 들어, 아동의 호흡기 감염과 연관된 병원체를 트랜스제닉 유제동물에게 투여하여 이 병원체 (예를 들어, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 헤모필루스 인플루엔자 및(또는) 네이세리아 메닝기티스)에 반응하는 항혈청을 생성할 수 있다. 이 병원체를 유제동물에게 투여되기 전에 임의로 처치 (예를 들어, 열 또는 포름알데히드와 같은 화학 물질에 노출시킴)하여 이들의 독성을 감소시킬 수 있다.
넓은 작용범위의 Ig를 생성하기 위하여, 다양한 병원체 (예를 들어, 다수의 박테리아 및(또는) 바이러스 병원체)를 트랜스제닉 유제동물에게 투여하였다. 이 과다면역 혈청은 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 감염을 예방, 안정화 또는 치료하기 위해 사용할 수 있으며, 이는 특히 선천성 또는 후천성 면역결핍증을 앓고 있는 포유동물의 치료에 유용하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 생산된 항체는 면역 시스템 억제, 예를 들어 신경 장애 치료 뿐만 아니라 특정 인간 세포 소거 및 특정 분자 조절에 사용할 수 있다. 예를 들어, 항-이디오타입 항체 (즉, 다른 항체를 억제하는 항체) 및 T-세포, B-세포 또는 사이토카인과 반응하는 항체가 자가면역 질환 또는 신경 장애 (예를 들어, 염증에 의한 신경 장애)를 치료하는 데 유용할 수 있다. 이들 항체는 항원을 투여하지 않은 트랜스제닉 유제동물로부터 수득할 수 있거나, 또는 B-세포, T-세포 또는 사이토카인 (예를 들어, TNFα)과 같은 항원을 투여한 트랜스제닉 유제동물로부터 수득할 수 있다.
항원을 투여하지 않은 트랜스제닉 유제동물로부터 생성된 트랜스제닉 항혈청은 인간 폴리클로날 항체, 바람직하게는 인간 IgG 분자를 포함하는 제약 제조에 사용할 수 있다. 이러한 인간 항체는 정맥내 이뮤노글로불린 (IVIG) 치료시 인간으로부터 단리된 항체 대신 사용할 수 있다.
임의로 트랜스제닉 항혈청은 하나 이상의 대상 항원에 대한 항체 반응성이 높을 수 있다. 예를 들어, 항혈청을 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, volume 2, p. 11.13.1-11.13.3, John Wiley ＆ Sons, 1995]에 기재된 것과 같은 표준 기술을 사용하여 정제하였다. 바람직한 정제 방법으로는 항원 또는 항체 코팅된 비드를 사용하는 침전법, 컬럼 크로마토그래피 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피), 자기 비드 친화도 정제법 및 플레이트-결합 항원을 사용하는 패닝법 (panning)이 있다. 또한, 트랜스제닉 항혈청은 하나 이상의 대상 항원과 접촉할 수 있으며, 항원에 결합한 항체는 항체/항원 복합체의 증가된 크기를 기준으로 비결합 항체로부터 분리될 수 있다. 단백질 A 및(또는) 단백질 G는 또한 IgG 분자를 정제하는 데 사용할 수 있다. 내인성 항체의 발현이 소거되지 않는 경우, 인간 Ig 경쇄 λ(Pharmingen)에 대한 단백질 A 및(또는) 항체는 내인성 유제동물 항체 또는 유제동물/인간 키메라 항체로부터 바람직한 인간 항체를 분리하는 데 사용할 수 있다. 단백질 A의 인간 Ig 중쇄에 대한 친화도는 소과 동물 Ig 중쇄에 대한 친화도보다 높으며, 이를 1 또는 2개의 유제동물 중쇄를 함유하는 다른 항체로부터 2개의 인간 중쇄를 함유하는 바람직한 Ig 분자를 분리하는 데 사용할 수 있다. 인간 Ig 경쇄 λ에 대한 항체를 1 또는 2개의 유제동물 Ig 경쇄를 갖는 Ig 분자로부터 2개의 인간 Ig λ 쇄를 갖는 바람직한 Ig 분자를 분리하는 데 사용할 수 있다. 부가적으로 또는 별법으로, 유제동물 Ig 중쇄 또는 경쇄에 특이적인 하나 이상의 항체를 음성 선별 단계에서 사용하여 1 또는 2개의 유제동물 중쇄 및(또는) 경쇄를 함유하는 Ig 분자를 제거할 수 있다.
생성된 항혈청은 그 자체로 항원에 대한 수동 면역화에 사용될 수 있다. 별법으로, 항혈청을 진단, 예방 또는 정제 용도 (예를 들어, 항원 정제용)를 갖는다.
별법으로, 항혈청을 투여한 후에, 트랜스제닉 소과 동물로부터 B-세포를 단리하여 하이브리도마 제조에 사용하였다. 예를 들어, 표준 기술을 사용하여 트랜스제닉 유제동물로부터의 B-세포를 골수종과 융합시켜 대상 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 생산할 수 있다 [Mocikat, J. Immunol. Methods 225:185-189, 1999; Jonak et al., Hum. Antibody Hybridomas 3:177-185, 1992; Srikumaran et al., Science 220:522, 1983]. 바람직한 하이브리도마는 B-세포를 트랜스제닉 유제동물로서 동일한 속 또는 종의 포유동물로부터의 골수종과 융합시켜 생성된 하이브리도마를 포함한다. 다른 바람직한 골수종은 Balb/C 마우스 또는 인간으로부터의 골수종이다. 이러한 경우, 특정 항원에 대한 외인성 모노클로날 항체를 제조하는 하이브리도마가 제공된다. 예를 들어, 이 기술을 이용하여 병원체에 특이적인 인간, 고양이, 개 등 (특정 인공 염색체에 따라 달라짐)의 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 바람직한 특성, 즉 증가된 결합 친화도를 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하는 방법이 공지되어 있다.
별법으로, 트랜스제닉 유제동물로부터의 B-세포는 유전학적으로 변형되어 종양 유전자 (예를 들어, ras, myc, abl, bcl2 또는 neu)를 발현시키거나, 또는 형질전환된 DNA 또는 RNA 바이러스 (예를 들어, 엡스타인 바르 (Epstein Barr) 바이러스 또는 SV40 바이러스)로 감염될 수 있다 [Kumar et al., Immunol. Lett. 65:153-159, 1999; Knight et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988; Shammah et al., J. Immunol. Methods 160-19-25, 1993; Gustafsson and Hinkula, Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994; Kataoka et al., Differentiation 62:201-211, 1997; Chatelut et al., Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998]. 생성된 무한증식의 B-세포는 또한 이론상 비제한적인 양의 항체를 생성하는 데 사용할 수 있다. Ig 또한 유제동물의 젖에서 분비되며, 유제동물 젖은 또한 외인성 항체의 공급원으로 사용될 수 있다.
다른 실시양태
상기 설명으로부터, 다양한 사용 및 조건에 적합하도록 본원에 기재된 본 발명에 대해 변화 및 변형이 만들어질 수 있다는 것이 명백해 질 것이다. 예를 들어, 다른 인큐베이션 시간 또는 온도 (예컨대, 25, 30, 35, 37, 38.5, 또는 40 ℃ 또는 더 높거나 또는 더 낮은 온도)는 막의 투과가능화, 공여자 유전 물질의 리프로그래밍, 막의 재밀봉, 및(또는) 난모세포 내로의 유전 물질의 전달에 사용될 수 있다. 상기 실시양태도 또한 하기 청구의 범위에 포함된다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌은 각각의 독립적인 문헌 또는 특허 출원이 참고문헌으로 포함된 것을 구체적이고 개별적으로 나타낸 바와 같이 본원에 참고문헌으로 포함된다.
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